检索结果-内蒙古大学图书馆

兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌多重PCR检测方法的建立

实验动物科学 2023年第4期40卷 10-16页

作者：张贺陶坤盛陈见兴王豪杰陈洪岩王玉娥夏长友中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学创新团队哈尔滨150069

目的建立兔源多杀性巴氏杆菌(Pm)、金黄色葡萄球菌(Sa)和肺炎克雷伯菌(Kp)的多重PCR方法。方法本研究参考Pm kmt1基因、Sa nuc基因和Kp kh1基因的保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm),采用控制单一变量法... 详细信息

目的建立兔源多杀性巴氏杆菌(Pm)、金黄色葡萄球菌(Sa)和肺炎克雷伯菌(Kp)的多重PCR方法。方法本研究参考Pm kmt1基因、Sa nuc基因和Kp kh1基因的保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm),采用控制单一变量法优化引物浓度,构建kmt1、nuc和kh1基因的重组质粒标准品pMDPm、pMD-Sa和pMD-Kp,确定最小检测量;以兔源支气管败血波氏杆菌和产气荚膜梭菌等9种病原体核酸样本确定多重PCR法的特异性;通过批间和批内实验验证其重复性;经检测疑似感染的临床样本与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果。结果最适退火温度为54.5℃;扩增kmt1和nuc基因的引物最适浓度均为1μL(10μmol/L),扩增kh1基因的引物最适浓度为0.5μL(10μmol/L);pMD-Pm最低检测限为20.6 copies/μL,pMDSa最低检测限为18.2 copies/μL,pMD-Kp最低检测限为23.2 copies/μL,表明其灵敏性高;该方法仅对Pm、Sa和Kp有特异性扩增条带,对其他病原体均无扩增条带,表明特异性较强;批间和批内检测结果一致,表明重复性较好;经临床样本检测Pm、Sa和Kp单独的阳性率分别为62.92%、25.84%和49.43%,与已报道的检测方法结果一致。结论本研究成功建立了一种能够同时快速检测兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的多重PCR方法。

关键词：多杀性巴氏杆菌金黄色葡萄球菌肺炎克雷伯菌多重PCR

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猫疱疹病毒ERA-LFD检测技术的建立与应用

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中国兽医科学 2022年第1期52卷 11-18页

作者：刘迪许鑫燕郑亚婷杨育鹏康洪涛姜骞杨鸣发刘家森曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为建立一种快速检测猫疱疹病毒(FHV)的酶促恒温扩增-横向流动试纸条(ERA-LFD)方法,根据GenBank上FHV TK基因保守区域序列,设计多对ERA特异性引物用于筛选最佳引物对及探针,以现场快速检测FHV。灵敏性试验表明,该方法的检测限为7.86×... 详细信息

为建立一种快速检测猫疱疹病毒(FHV)的酶促恒温扩增-横向流动试纸条(ERA-LFD)方法,根据GenBank上FHV TK基因保守区域序列,设计多对ERA特异性引物用于筛选最佳引物对及探针,以现场快速检测FHV。灵敏性试验表明,该方法的检测限为7.86×10^(1)copies/μL,比普通PCR的检测下限高10倍,与实时荧光定量PCR方法的检测限相当。特异性试验表明,该检测方法与猫细小病毒、猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒等无交叉反应。重复性试验表明,组内的变异系数在1.15%~4.76%之间,组间变异系数在2.09%~2.66%之间,均小于5%。对30份临床样品进行检测,该方法的阳性检出数为6,包含用普通PCR方法的检出的5份阳性病料。对临床检测为阳性的ERA扩增产物进行测序,BLAST对比结果证实为FHV毒株。综上所述,建立的ERA-LFD方法可用于猫疱疹病毒的快速检测及流行病学调查。

关键词：猫疱疹病毒 ERA-LFD 快速检测

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病毒载体疫苗免疫效力的增强策略

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中国预防兽医学报 2022年第10期44卷 1116-1124页

作者：张心雨吴红霞王涛潘力付强孙元仇华吉佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东佛山528231 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

自从人类首次发现痘苗病毒可以用于预防天花以来,疫苗一直在疾病防控中发挥着至关重要的作用。随着免疫学与分子生物学理论和技术的发展及应用,疫苗的安全性、有效性、稳定性等得到全面提高。基于基因工程技术的病毒载体疫苗与传统疫苗... 详细信息

自从人类首次发现痘苗病毒可以用于预防天花以来,疫苗一直在疾病防控中发挥着至关重要的作用。随着免疫学与分子生物学理论和技术的发展及应用,疫苗的安全性、有效性、稳定性等得到全面提高。基于基因工程技术的病毒载体疫苗与传统疫苗相比,安全性、靶向性和可控性更高,且适于研制多价或多联疫苗,因此成为疫苗研发的热点。但该类疫苗存在免疫效力低等问题,仍需改进。本文分别通过对目的基因和病毒载体的改造,以及免疫策略的改进等方面总结了几种提高病毒载体疫苗免疫效力的策略,为相关疫苗的研究提供参考。

关键词：免疫效力疾病防控病毒载体疫苗痘苗病毒传统疫苗疫苗研发基因工程技术免疫学

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表达荧光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因重组非洲猪瘟病毒的构建

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病毒学报 2021年第5期37卷 1128-1134页

作者：康力周仕君宋洁李江南翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室基础免疫创新团队哈尔滨150069

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病,家猪感染ASFV强毒株后死亡率接近100%。为了研究ASFV的致病机制,利用绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因构... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和野猪引起的一种高致病性传染病,家猪感染ASFV强毒株后死亡率接近100%。为了研究ASFV的致病机制,利用绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因构建重组病毒已经广泛应用,但易于定量检测且适用于高通量筛选的重组ASFV目前没有报道。本研究以ASFV HLJ/18分离株为亲本病毒,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术将表达Gaussia荧光素酶(Gluc)和EGFP的报告基因表达盒插入到ASFV的K145R基因的位置,构建可以同时表达Gluc和EGFP的重组ASFV(rASFV⁃Gluc⁃EGFP)。通过PCR鉴定、Gluc和EGFP表达的检测,确定获得的重组ASFV能够感染猪肺泡巨噬细胞且表达Gluc和EGFP。对构建的重组病毒和亲本病毒进行生长曲线比较,结果表明插入的报告基因不影响病毒在猪肺泡巨噬细胞中的复制。F5、F10和F15代重组病毒基因鉴定和报告基因表达检测结果表明,重组病毒能稳定表达插入的双报告基因。本研究成功构建了表达Gluc和EGFP的重组ASFV,可以针对报告基因进行定量检测和高通量筛选,为ASFV的感染和致病机制研究奠定坚实的基础。

关键词：非洲猪瘟病毒(ASFV) 重组病毒报告基因荧光素酶

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牛冠状病毒N蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

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中国动物传染病学报 2024年第6期32卷 120-127页

作者：梁彤曹存王芳姜志刚于德斌徐晓静崔久辉贾斌尹鑫常继涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室牛羊传染病研究创新团队哈尔滨150069 哈尔滨维科生物技术有限公司研发部哈尔滨150069 内蒙古农业大学兽医学院呼和浩特010010 呼伦贝尔农垦谢尔塔拉农牧场有限公司呼和浩特021012 黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院齐齐哈尔161005

为表达牛冠状病毒(BCoV)N蛋白并制备抗N蛋白单克隆抗体,将N蛋白表达基因克隆至原核表达载体pCold-GST,利用大肠杆菌BL21(DE3)表达出N蛋白。SDS-PAGE结果显示,N蛋白主要以可溶性形式表达,分子量约为77 kDa,亲和纯化后纯度为90%。Western ... 详细信息

为表达牛冠状病毒(BCoV)N蛋白并制备抗N蛋白单克隆抗体,将N蛋白表达基因克隆至原核表达载体pCold-GST,利用大肠杆菌BL21(DE3)表达出N蛋白。SDS-PAGE结果显示,N蛋白主要以可溶性形式表达,分子量约为77 kDa,亲和纯化后纯度为90%。Western blot进一步鉴定发现,重组N蛋白与全病毒多克隆抗体具有良好的反应原性。经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,以该纯化蛋白免疫Balb/c小鼠,进行融合、筛选获得3株单克隆抗体,分别命名为1D11、5C2和2B11。细胞上清单克隆抗体效价均达1∶320,3株单克隆抗体均属IgG亚类,Western blot与IFA鉴定3株单克隆抗体与真核表达的N蛋白具有特异性反应。该研究内容为进一步研究N蛋白的结构、功能及建立快速诊断BCoV方法奠定了基础。

关键词：牛冠状病毒原核表达 N蛋白单克隆抗体

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非洲猪瘟病毒的免疫逃逸策略

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微生物学报 2021年第2期61卷 249-262页

作者：孙茂文王涛孙元杨玉莹仇华吉长江大学动物科学学院湖北荆州434023 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种猪烈性传染病。目前无商品化的ASF疫苗,一旦发病,仅能依靠快速扑杀进行防控,严重威胁我国养猪及相关行业的健康发展。ASF疫苗研发面临的... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种猪烈性传染病。目前无商品化的ASF疫苗,一旦发病,仅能依靠快速扑杀进行防控,严重威胁我国养猪及相关行业的健康发展。ASF疫苗研发面临的主要困难是对ASFV的毒力相关基因、致病及其免疫逃逸机制知之甚少。本文对ASFV的免疫逃逸研究进行了总结,探讨了ASFV免疫逃逸基因及其编码蛋白的功能,以便加深对ASFV及其免疫逃逸策略的认知,为致病机制研究和疫苗研发提供借鉴。

关键词：非洲猪瘟病毒免疫逃逸天然免疫适应性免疫

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猪源GSDMA蛋白多克隆抗体的制备与初步应用

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中国预防兽医学报 2022年第12期44卷 1311-1316,1331页

作者：李帅宋洁周仕君刘佳李江南翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/基础免疫创新团队黑龙江哈尔滨150069 黑龙江省免疫学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

Gasdermin A(GSDMA)作为Gasdermin(GSDM)蛋白家族的一员,参与细胞的炎症反应,其经切割产生的片段可以诱导细胞焦亡。为制备猪GSDMA(pGSDMA)多克隆抗体,本研究构建了重组表达质粒pET-21apGSDMA,转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导,表... 详细信息

Gasdermin A(GSDMA)作为Gasdermin(GSDM)蛋白家族的一员,参与细胞的炎症反应,其经切割产生的片段可以诱导细胞焦亡。为制备猪GSDMA(pGSDMA)多克隆抗体,本研究构建了重组表达质粒pET-21apGSDMA,转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导,表达并纯化了重组pGSDMA蛋白。将纯化的该重组蛋白免疫小鼠制备pGSDMA多克隆抗体(pAb),并进行western blot和间接免疫荧光试验鉴定。结果显示,pGSDMA pAb能够特异性地识别外源表达的pGSDMA蛋白和猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中内源表达的pGSDMA蛋白。利用该pAb检测猪主要组织器官中pGSDMA蛋白的表达,结果显示其能识别猪不同组织器官中的pGSDMA蛋白,且pGSDMA在猪心脏中的表达量最低,在肝、脾、肺和肾中的表达量较高。利用该pAb检测不同剂量高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染PAMs中p GSDMA的表达,结果显示pGSDMA蛋白的表达量随着病毒感染剂量的增加而降低,表明pGSDMA在HP-PRRSV感染过程中发挥相关生物学作用。本研究首次制备了pGSDMA pAb,为深入探究pGSDMA生物学功能奠定了基础。

关键词： GSDMA 原核表达多克隆抗体高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒

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胸膜肺炎放线杆菌MnmE基因突变株的构建及其生物学特性的研究

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中国预防兽医学报 2023年第3期45卷 225-231页

作者：赵济钰王璐孙婧王春来李刚刘思国东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm ... 详细信息

为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌(APP)生长特性及致病性的影响,本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因,分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E,并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm E通过接合转移方式导入受体菌S8中,利用氯霉素抗性筛选Mnm E基因缺失株(S8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定;将重组质粒pls88-Mnm E电转化至S8△Mnm E感受态细胞中,经卡那抗性筛选Mnm E全长基因回补株(cS8△Mnm E),并经PCR和测序鉴定。将上述两株菌分别在无抗性培养基中传10代每代均经相应PCR鉴定其遗传稳定性。采用q RT-PCR检测Mnm E基因突变对其上下游基因转录水平的影响。结果显示,突变株S8△Mnm E和回补株cS8△Mnm E均正确构建,且遗传稳定性均较好;q RT-PCR结果显示,S8△Mnm E株Mnm E上下游基因的转录水平均与亲本株无明显差异。通过检测不同时间点的OD_(600nm)值并绘制生长曲线分析上述两种菌与亲本株分别在20种不同氨基酸单独缺失培养基中的生长特性;通过微量结晶紫染色法,测定3株菌在不同培养时间生物被膜(BF)的形成能力;通过测定3株菌在不同浓度H_(2)O_(2)中的增殖能力,分析3株菌的体外抗氧化应激能力。结果显示,S8、S8△Mnm E及c S8△Mnm E株在含全部20种氨基酸的化学合成培养基中的增殖速度基本一致,但在谷氨酰胺(Gln)、色氨酸(Trp)、谷氨酸(Glu)缺失时,S8△Mnm E株的增殖水平明显低于亲本株,而在甲硫氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)缺失时S8△Mnm E株的生长速度快于亲本株。培养36 h、48 h时各菌株BF的形成能力基本无差异,但在培养72 h时,S8△Mnm E株BF的形成能力约为亲本株的1.5倍(P<0.001);与S8株相比,S8△Mnm E株经不同浓度H_(2)O_(2)处理后的活菌数均明显降低,且降低水平与H_(2)O_(2)的浓度成正比。而回补株则基本恢复了亲本株的生长特性。通过对大蜡螟的致病性试验测定S8与S8△Mnm E的半数致死量(LD_(50)),结果显示S8的LD_(50)为3.16×10^(8)cfu/mL,S8△Mnm E株的LD_(50)为1.58×10^(9)cfu/mL,前者比后者升高约5倍。本研究结果首次表明Mnm E可参与APP BF的形成,并影响其体外抗氧化应激能力及调控APP生长,降低APP的致病性。为进一步阐明APP的致病机制提供参考依据。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌 MnmE基因基因突变株

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N9亚型禽流感病毒NA蛋白在昆虫细胞中的表达与鉴定

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中国预防兽医学报 2022年第7期44卷 777-781页

作者：衡武昌崔鹏飞张元成邢鑫谷文丽颜成孔兴天王丛丛彭大新邓国华陈化兰扬州大学兽医学院江苏扬州225009 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

为了表达具有反应原性的N9亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)蛋白,本研究将DK/HuN/S11670/2015(H11N9)株NA基因克隆至杆状病毒转移载体中,构建重组转移载体pFastBacHT A-N9并经PCR和测序鉴定后转化DH10Bac感受态细胞,经PCR鉴定获得了... 详细信息

为了表达具有反应原性的N9亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)蛋白,本研究将DK/HuN/S11670/2015(H11N9)株NA基因克隆至杆状病毒转移载体中,构建重组转移载体pFastBacHT A-N9并经PCR和测序鉴定后转化DH10Bac感受态细胞,经PCR鉴定获得了重组杆粒rBacmid-N9,转染昆虫细胞sf21获得重组杆状病毒rBaculovirus-N9。将获得的P3代重组杆状病毒感染sf21细胞后经间接免疫荧光试验(IFA)检测N9蛋白的表达和定位,采用western blot鉴定N9蛋白的反应原性。将杆状病毒表达的重组N9蛋白包被ELISA酶标板,初步建立间接ELISA方法,利用该方法分别检测N9蛋白抗体阳性鸡血清和阴性鸡血清。IFA和western blot结果显示,N9蛋白正确表达且主要锚定在细胞膜上,表达的N9蛋白可以与鼠源N9蛋白单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA方法结果显示,初步建立的间接ELISA方法可以检测鸡血清中的N9抗体。上述结果表明,经杆状病毒—昆虫细胞表达的N9蛋白具有良好的反应原性,为N9 AIV检测试剂盒的研发奠定了基础。

关键词：禽流感病毒神经氨酸酶 N9亚型昆虫细胞杆状病毒

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非洲猪瘟病毒A137R蛋白单克隆抗体的制备与表位鉴定

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中国预防兽医学报 2022年第4期44卷 402-410页

作者：向志达李长尧张涛清张元峰黄丽杨玉莹翁长江中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/基础免疫创新团队黑龙江哈尔滨150069 长江大学动物科学学院湖北荆州434025

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)A137R蛋白鼠源单克隆抗体(MAb),本研究通过原核系统表达并纯化了重组A137R(rA137R),将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到2株能够稳定分泌A137R MAb的杂交瘤细胞株3D1和2C3。亚类试剂盒鉴定结果显示,两... 详细信息

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)A137R蛋白鼠源单克隆抗体(MAb),本研究通过原核系统表达并纯化了重组A137R(rA137R),将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到2株能够稳定分泌A137R MAb的杂交瘤细胞株3D1和2C3。亚类试剂盒鉴定结果显示,两株MAb重链亚类均为IgG1,轻链亚类均为Kappa链。采用间接ELISA方法测得MAb 3D1和2C3的腹水效价均高于10^(5),选取效价较高的MAb 3D1用于后续试验。采用western blot检测制备的MAb 3D1与293T细胞中过表达的A137R(不同剂量)及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)后(感染后不同时间)天然表达的A137R的反应性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测MAb 3D1与293T细胞中过表达的A137R的反应性。Western blot结果显示,过表达A137R的293T细胞出现了15 ku左右的特异性条带,且随着转染质粒量浓度的增加,蛋白表达量增加;感染ASFV的PAMs中(感染后8 h)出现了15 ku左右的特异性条带,且随着感染时间的延长,蛋白表达量增加。IFA结果显示,在过表达A137R的293T细胞中出现绿色荧光。以上结果表明,制备的MAb 3D1既能够与过表达的A137R反应,也能够与天然表达的A137R反应,反应性较强。将MAb 3D1用于激光共聚焦试验中检测ASFV感染PAMs后不同时间A137R的细胞定位;用于免疫共沉淀(Co-IP)试验中检测293T细胞中过表达的A137R和Flag-Agarose结合的反应性。激光共聚焦试验结果显示,ASFV感染PAMs后6 h出现绿色荧光,且荧光主要在细胞质中,随着感染时间的延长,绿色荧光逐渐增多增强,表明A137R主要定位于细胞质中。Co-IP试验结果显示,MAb 3D1可以检测到结合在Beads上的A137R,出现约15 ku的特异性条带,表明MAb 3D1可以用于Co-IP试验。利用一系列表达部分重叠的重组A137R片段并经western blot鉴定两株MAb识别的表位;根据western blot结果合成一系列多肽并包被ELISA板,采用间接ELISA方法进一步筛选MAb识别的抗原表位,并利用western blot验证筛选到的抗原表位。结果显示,A137R氨基酸序列中的18NFHRCAWEE26和64AWHEVPECREFI75分别为MAb 3D1和2C3的抗原表位。本研究首次制备了ASFV A137R蛋白的MAb,并进行了初步应用研究,还对其进行了表位鉴定,为进一步将该MAb利用于ASFV的检测和疫苗研究提供了实验依据。

关键词：非洲猪瘟病毒 A137R蛋白单克隆抗体抗原表位

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