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中国预防兽医学报 2019年第1期41卷 6-11页

作者：马骁王翀王金良王子龙王鑫鑫帅磊王喜军葛金英温志远步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

本研究前期利用RNA干扰技术在人类全基因组水平上筛选到了与狂犬病病毒(RABV)生命周期有关的宿主基因AP2M1。为进一步研究AP2M1影响RABV感染的机制,本实验在人胚胎肾细胞(HEK-293)中沉默或过表达AP2M1,采用高内涵筛选、病毒滴度检测等... 详细信息

本研究前期利用RNA干扰技术在人类全基因组水平上筛选到了与狂犬病病毒(RABV)生命周期有关的宿主基因AP2M1。为进一步研究AP2M1影响RABV感染的机制,本实验在人胚胎肾细胞(HEK-293)中沉默或过表达AP2M1,采用高内涵筛选、病毒滴度检测等方法分析AP2M1对RABV感染率的影响。结果显示:敲低AP2M1,RABV感染率显著下降;过表达AP2M1,RABV感染率上升。酸绕过实验显示AP2M1在RABV感染过程中发挥作用。激光共聚焦观察显示RABV G蛋白与AP2M1无共定位。免疫共沉淀实验显示AP2M1与RABV G蛋白无直接相互作用。本研究结果表明,AP2M1基因在RABV感染过程中发挥作用,但不是通过与RABV G蛋白的直接作用影响病毒的感染。本研究为阐明AP2M1在RABV生命周期中具体作用奠定了基础。

关键词： AP2M1 狂犬病病毒病毒侵入 G蛋白

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基于RNAscope^(■)原位杂交技术对PRRSV感染组织样本的检测分析

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中国预防兽医学报 2019年第1期41卷 40-45页

作者：马泽林张永莉刘强胡守萍张卓何希君中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为扩大RNAscope~?原位杂交技术(RNAscope~?ISH)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基础研究中的应用范围,本研究将该技术与免疫组织化学技术(IHC)相结合,通过条件优化建立了RNAscope~?ISH-IHC双重染色技术。经检测不同病毒感染的组织切片... 详细信息

为扩大RNAscope~?原位杂交技术(RNAscope~?ISH)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基础研究中的应用范围,本研究将该技术与免疫组织化学技术(IHC)相结合,通过条件优化建立了RNAscope~?ISH-IHC双重染色技术。经检测不同病毒感染的组织切片中的PRRSV表明该技术具有良好的特异性。采用该双重染色技术检测PRRSV感染的猪淋巴结组织切片中巨噬细胞感染PRRSV情况,结果显示PRRSV核酸主要存在于巨噬细胞胞浆中,在胞核中也有分布,但在一些非巨噬细胞中也散在PRRSV阳性信号,表明PRRSV不仅在猪淋巴结巨噬细胞中复制。利用该双重染色技术检测PRRSV感染后不同时间点猪胸腺组织切片中凋亡相关调节基因Bid、Bcl-xl表达水平,结果显示一段时间内Bid基因转录水平上调、Bcl-xl基因转录水平下调,与同条件下荧光定量PCR结果一致。综上,本研究建立的RNAscope~?ISH-IHC双重染色技术结合了RNAscope~?ISH与IHC各自的优势,不仅能够检测病毒感染后在组织中的定位,还可以分析病毒感染后宿主内源性基因转录的变化趋势,实现了在同一组织切片中对核酸与蛋白的双重检测。经验证该检测方法适用于PRRSV实验室研究,为PRRSV的相关基础研究提供新的检测手段。

关键词： RNAscope^(■)原位杂交免疫组织化学细胞凋亡猪繁殖与呼吸综合征病毒

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关于高致病性禽流感灭活疫苗的认知和应用误区

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畜牧兽医科技信息 2021年第10期37卷 7-9页

作者：麻琦宋守生任殿新戈永军田国彬曾显营中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/国家禽流感参考实验室黑龙江哈尔滨150069 内蒙古赤峰市敖汉旗农牧局内蒙古赤峰024300 敖汉惠丰种禽有限责任公司内蒙古赤峰024300

养禽业是农业、农村发展和农民增收的重要组成部分。近20年来,H5和H7N9亚型高致病性禽流感先后对我国家禽养殖业造成严重危害,同时威胁人类健康,引起重大公共卫生关注。疫苗免疫联合扑杀的措施是我国有效控制禽流感的重要策略。国家禽... 详细信息

养禽业是农业、农村发展和农民增收的重要组成部分。近20年来,H5和H7N9亚型高致病性禽流感先后对我国家禽养殖业造成严重危害,同时威胁人类健康,引起重大公共卫生关注。疫苗免疫联合扑杀的措施是我国有效控制禽流感的重要策略。国家禽流感参考实验室创制出一系列防控疫苗并应用,有效控制了我国H5和H7亚型禽流感,保障养禽业健康发展,稳定了禽蛋产品的供应,并成功从家禽源头阻断了人感染H7N9流感病毒,产生巨大经济和社会效益。但在临床应用中,对疫苗的认知和应用还存在一些误区,成为形成家禽免疫防控薄弱环节的重要因素。本文简要总结和分析了对疫苗的相关认知和应用误区,并提出科学建议,以期为高致病性禽流感防控实践提供参考。

关键词：高致病性禽流感疫苗认识和使用误区

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利用CRISPR/Cas9技术构建流感病毒高产细胞系MDCK-Tpl2^(-/-)

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中国生物工程杂志 2019年第1期39卷 46-54页

作者：刘赛宝李亚芳王辉王伟冉多良陈洪岩孟庆文新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

Tpl2是调节I型(IFNα/β)和II型(IFNγ) IFN的关键调控因子,对病毒感染期间产生有效免疫应答至关重要。为了建立支持流感病毒高效繁殖的新型MDCK细胞系,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tpl2基因敲除的MDCK细胞,绘制其细胞生长曲线;根... 详细信息

Tpl2是调节I型(IFNα/β)和II型(IFNγ) IFN的关键调控因子,对病毒感染期间产生有效免疫应答至关重要。为了建立支持流感病毒高效繁殖的新型MDCK细胞系,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tpl2基因敲除的MDCK细胞,绘制其细胞生长曲线;根据《中国药典》第三部,对细胞进行形态检查、内外源因子和致瘤性检测;流感病毒接种细胞(MOI=0. 1),测定12h、24h、48h、72h细胞培养上清的血凝滴度及72h TCID50滴度。结果:靶基因组测序结果显示,获得一株稳定敲除Tpl2的MDCK细胞(MDCK-Tpl2^(-/-));其与亲本细胞生长速率无显著差异,均为贴壁、上皮样细胞形态;细胞内细菌、真菌、支原体、病毒及致瘤性检测均为阴性;病毒接种后12h、24h、48h、72h,MDCK-Tpl2^(-/-)细胞培养上清的血凝效价提高了1. 78～2. 5倍。病毒接种后72h,MDCK-Tpl2^(-/-)细胞培养上清病毒的TCID50滴度提高了2. 8倍。结果表明,利用Tpl2缺陷型MDCK细胞系可以提高流感病毒产量,为提升疫苗质量奠定基础。

关键词： Tpl2 CRISPR/Cas9 MDCK-Tpl2^-/-细胞细胞质控禽流感病毒

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牛副流感病毒3型核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

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中国预防兽医学报 2019年第5期41卷 495-500页

作者：李德栋向文杰林俊朱远茂薛飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室

为建立以牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)为包被抗原的间接ELISA方法,本研究扩增BPIV3的NP基因并克隆于原核表达载体,获得重组表达质粒p ET30-NP。将其转化至表达菌BL21(DE3),获得了可溶性表达的重组N蛋白,用镍柱在非变性条件下... 详细信息

为建立以牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)为包被抗原的间接ELISA方法,本研究扩增BPIV3的NP基因并克隆于原核表达载体,获得重组表达质粒p ET30-NP。将其转化至表达菌BL21(DE3),获得了可溶性表达的重组N蛋白,用镍柱在非变性条件下纯化后将其作为包被抗原,建立了检测BPIV3抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示作为包被抗原的重组N蛋白仅与BPIV3阳性牛血清发生特异性反应,与牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒等牛的常见病原无血清学交叉反应,表明其特异性较强。牛BPIV3阳性血清在1:640倍稀释时按该方法检测仍为阳性,显示该方法具有较高的敏感性。重复性试验显示批内变异系数小于6%,批间变异系数小于12%,表明该方法具有较好的稳定性。对94份牛血清的比较试验显示,本研究建立的间接ELISA方法与病毒中和试验的符合率为98%。利用该方法检测了394份采自接种过BPIV3灭活苗牛场的血清样品和95份未接种疫苗牛场的血清样品,结果接种疫苗的牛血清均呈强阳性,而95份未接种疫苗牛血清的阳性率为80%。本研究建立的间接ELISA方法可以试用于国内BPIV3的流行病学调查和免疫监测,为国内BPIV3的防控提供技术支持。

关键词：牛副流感病毒3型重组N蛋白间接ELISA

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H146-like鹅嵌杯病毒TaqMan-MGB PCR检测方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2020年第10期42卷 1019-1024页

作者：郑敏张世忠王劭谢开春江丹丹肖世峰陈少莺邓国华福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013 福建省南平市延平区畜牧兽医水产局福建南平353000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为建立检测H146-like鹅嵌杯病毒(GCV)的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank已登录的H146-like GCV基因组(KY399947)的NS基因保守区序列,设计合成一对能够特异性扩增134 bp片段的特异性引物(GCV-QP3/GCV-QP4)和TaqMan-MGB探针(GCV-Probe),经过反应体系和条件优化,建立了检测H146-like GCV的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。当质粒标准品为5.07×10^2拷贝/μL^5.07×10^9拷贝/μL时,荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数可达0.995。特异性试验结果显示,该方法对水禽常见病毒(如鹅星状病毒、鹅副粘病毒、鹅细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒与鸭坦布苏病毒等)的检测均为阴性,仅对H146-like GCV检测为阳性,特异性较强;敏感性试验结果显示,该方法可以检测到的最低质粒标准品为5.07×10^2拷贝/μL,而常规PCR方法检测该质粒标准品最低为5.07×10^4拷贝/μL,敏感性高;批内和批间的变异系数均小于1.6%,重复性良好。对福建省62份疑似临床组织样品进行检测,结果显示TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法阳性检出率为93.5%(58/62),而常规PCR方法的阳性检出率为72.6%(45/62),两种方法的符合率为77.59%。本研究建立的荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏性高,重复性好,在H146-like GCV的快速检测中具有良好的应用前景。

关键词：鹅嵌杯病毒 RNA病毒荧光定量PCR TaqMan探针病毒检测

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马属动物主要传染病疫苗和诊断技术的研制与推广应用

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中国科技成果 2020年第20期21卷 26-28页

作者：无王晓钧胡哲郭巍戚亭刘荻萩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室国家马传染性贫血参考实验室国家马鼻疽参考实验室不详

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(以下简称"哈兽研")马传染病和慢病毒病研究创新团队(以下简称"马病团队")70年来专注马传染病的研究,是国家认定的国家马传染性贫血参考实验室、国家马鼻疽参考实验室,世界动物卫生... 详细信息

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(以下简称"哈兽研")马传染病和慢病毒病研究创新团队(以下简称"马病团队")70年来专注马传染病的研究,是国家认定的国家马传染性贫血参考实验室、国家马鼻疽参考实验室,世界动物卫生组织OIE认定的马传染性贫血参考实验室.在历史上,团队早期领导人兽医免疫学家中国工程院沈荣显院士研制成功了马传染性贫血病毒弱毒疫苗,成功控制了该病在国内的流行,并获得国家技术发明奖一等奖.

关键词：马传染性贫血中国农业科学院兽医免疫学马属动物弱毒疫苗国家技术发明奖哈兽研中国工程院

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绵马酚抑制多粘菌素耐药关键蛋白MCR-1的机制研究

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中国预防兽医学报 2020年第5期42卷 427-433页

作者：贾月华欣刘思国吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 东北林业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150040

mcr-1是近几年发现的一种多粘菌素耐药基因,该基因可随质粒在不同菌株间快速传播,目前已在多个国家及地区被检出,本研究团队前期筛选发现联合使用绵马酚与多粘菌素时可以抑制mcr-1阳性大肠杆菌的生长。为了评价两者联合使用时的抑菌效果... 详细信息

mcr-1是近几年发现的一种多粘菌素耐药基因,该基因可随质粒在不同菌株间快速传播,目前已在多个国家及地区被检出,本研究团队前期筛选发现联合使用绵马酚与多粘菌素时可以抑制mcr-1阳性大肠杆菌的生长。为了评价两者联合使用时的抑菌效果,本研究采用棋盘稀释法对mcr-1阳性大肠杆菌进行了绵马酚与多粘菌素联合药敏实验,结果显示,当联合使用绵马酚与多粘菌素时相比单独使用多粘菌素时,多粘菌素的MIC由8μg/m L降低至1μg/m L,FIC指数小于0.5,二者属于协同作用。以终浓度为32μg/m L绵马酚与10μg/m L多粘菌素联合使用,进一步通过平板计数和透射电镜检测其杀菌效果和大肠杆菌菌体的破损程度,结果显示,当联合使用绵马酚与多粘菌素时,大肠杆菌在2 h^8 h逐渐全部死亡,大肠杆菌菌体破损最严重;但不管是单独使用绵马酚还是多粘菌素,大肠杆菌均不能被彻底杀灭。采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法分别提取mcr-1阳性大肠杆菌JD08菌株和含有16μg/m L的绵马酚的mcr-1阳性大肠杆菌JD08菌株中类脂A,利用质谱仪检测类脂A的结构,结果显示在绵马酚存在的情况下,MCR-1蛋白的作用受到抑制,发生转移的酰基键含量大大减少。采用双酶切法构建PET-28a-mcr-1重组表达载体,经诱导表达后通过镍柱亲和层析纯化得到MCR-1蛋白,利用Biacore大分子作用仪验证绵马酚与重组MCR-1蛋白的相互作用,结果显示绵马酚与MCR-1蛋白之间的亲和力为1.47μmol/L,属于直接结合。表明单独使用绵马酚对mcr-1阳性大肠杆菌无效,但其与多粘菌素联合时则产生了良好的抑菌及杀菌效果,绵马酚是MCR-1的小分子抑制剂。本研究首次确认了绵马酚是MCR-1的小分子抑制剂,对于开发新型抗多粘菌素耐药菌的药物具有重要意义。

关键词：大肠杆菌多粘菌素耐药关键蛋白MCR-1 绵马酚抑制剂大分子互作

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鸭源H7N9亚型流感病毒HA蛋白的真核表达及其免疫保护效力分析

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中国预防兽医学报 2019年第1期41卷 58-62页

作者：周陈陈梁立滨赵青青黄山雨李奇兵王广文李俊平赵玉辉曾显营施建忠李呈军陈化兰姜丽中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为进行鸭源H7N9亚型流感病毒HA蛋白表达纯化及其免疫保护效力分析,本研究以鸭源流感病毒A/Duck/Fujian/S4170/2014 (H7N9)HA基因为模板,PCR扩增后将HA片段克隆至昆虫细胞表达载体p Fast Bac1中。将构建的重组质粒p FBacH7HA转化DH10Bac... 详细信息

为进行鸭源H7N9亚型流感病毒HA蛋白表达纯化及其免疫保护效力分析,本研究以鸭源流感病毒A/Duck/Fujian/S4170/2014 (H7N9)HA基因为模板,PCR扩增后将HA片段克隆至昆虫细胞表达载体p Fast Bac1中。将构建的重组质粒p FBacH7HA转化DH10Bac感受态细胞,提取PCR鉴定为阳性的重组杆粒Bacmid-H7HA,转染SF9昆虫细胞。结果显示重组Bacmid-H7HA表达HA蛋白,并装配成重组杆状病毒,将该病毒感染High Five细胞,大量表达H7-HA蛋白。免疫荧光试验、SDS-PAGE及western blot分析结果表明H7-HA蛋白正确表达且纯度达90%以上,血凝试验表明表达蛋白具有良好的生物活性。利用纯化的H7-HA蛋白免疫SPF鸡后进行攻毒保护试验,评价该蛋白作为免疫原对SPF鸡的免疫保护效力,结果显示HA蛋白免疫组鸡只得到100%保护。以上结果表明本研究表达纯化的H7-HA蛋白可以作为防控H7亚型禽流感的候选亚单位疫苗。

关键词： H7N9 HA蛋白杆状病毒表达免疫保护

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猫疱疹病毒1型HR-1毒株的分离鉴定及致病性分析

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中国兽医学报 2019年第6期39卷 1113-1117页

作者：刘晓晓刘永相张继凯程晨曦黄佳培田进曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

从哈尔滨市某宠物医院疑似感染1型猫疱疹病毒发病猫的眼、鼻拭子中分离到1株病毒,经过电镜观察、分子生物学、血清学和动物回归试验鉴定,分离到的病毒为猫疱疹病毒1型,命名为HR-1株。HR-1可在猫肾细胞(CRFK)上产生典型细胞病变,病毒滴... 详细信息

从哈尔滨市某宠物医院疑似感染1型猫疱疹病毒发病猫的眼、鼻拭子中分离到1株病毒,经过电镜观察、分子生物学、血清学和动物回归试验鉴定,分离到的病毒为猫疱疹病毒1型,命名为HR-1株。HR-1可在猫肾细胞(CRFK)上产生典型细胞病变,病毒滴度可达到108 TCID50/mL。提取病毒基因组DNA经过gD引物扩增后,得到1条1 125 bp大小的特异性条带,经测序表明其与C-27毒株gD基因序列相似性达100%。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,接种HR-1的单层CRFK细胞出现特异性荧光。电镜观察可见圆形、有囊膜、直径约为150 nm的病毒颗粒。为了解该毒株的毒力及致病性,通过感染中国家猫进行致病性试验。结果表明,HR-1为强毒株,对家猫的致死率为100%;HR-1感染家猫后主要表现为眼结膜炎和鼻气管炎;通过实时荧光定量PCR能从感染家猫的眼、鼻拭子中检测到病毒粒子核酸,并且于感染后4~6 d病毒核酸达到最高峰。本试验为猫疱疹病毒的诊断和致病机制的研究提供了参考价值.

关键词：猫疱疹病毒1型猪传染性鼻气管炎 HR-1株 gD基因

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