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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：高彩霞辛畅权金强陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室150069黑龙江省哈尔滨市香坊区哈平路678号中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室150069黑龙江省哈尔滨市香坊区哈平路678号东北农业大学生命科学学院 150030黑龙江省哈东北农业大学生命科学学院 150030黑龙江省哈尔滨市香坊区木材街59号

无特定病原体(specific pathogen free,SPF)大白猪(Sus scrofa)和长白猪(Sus scrofa)作为重要的实验动物,已净化了 14种病原,生殖生理和血液生理生化特性基本稳定,与其他实验用小型猪相比差异不大;且群体遗传分化较小,遗传结构稳定,作... 详细信息

无特定病原体(specific pathogen free,SPF)大白猪(Sus scrofa)和长白猪(Sus scrofa)作为重要的实验动物,已净化了 14种病原,生殖生理和血液生理生化特性基本稳定,与其他实验用小型猪相比差异不大;且群体遗传分化较小,遗传结构稳定,作为实验动物初步用于疫病研究具有较好的效果.然而众所周知,猪群个体差异所表现的遗传多样性对实验结果会产生较大的影响,可导致动物实验重复性差,数据结果离散度高,因此对其进行遗传学质量控制研究十分必要.为分析实验用SPF大白猪、长白猪的线粒体 DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)控制区(displacement-loop region,D-loop 区)遗传多样性,揭示其母系遗传结构,本研究提取SPF大白猪和长白猪基因组DNA,同时以我国地方品种巴马小型猪和融水小型猪为对照,应用PCR技术扩增其mtDNA D-loop区,进行测序比对.结果显示,PCR扩增长度约为1500 bp左右,与预期结果一致.107个样本中共检测到40个多态位点,其中有34个转换,6个颠换,转换频率远高于颠换,由此界定为13个单倍型,与地方品种相比,大白猪和长白猪单倍型数较少,分别含有3种和2种特有单倍型,只有1个共享单倍型H4.两猪群中各存在1个优势单倍型,频率分别为17.76％和28.97％.将13种单倍型序列提交到GenBank,并获得相应检索号MH113789-MH113801.单倍型多样度(Hd)分析,融水小型猪单倍型多样度最高(0.767),长白猪最低(0.429),大白猪和巴马小型猪分别为0.566和0.503.此外,中介网络关系图显示13种单倍型分为3个不同进化枝,与系统进化树结果相同.大部分大白猪、长白猪与欧洲猪种亲缘关系较近;大部分巴马小型猪、融水小型猪与亚洲本地猪种亲缘关系较近;而2个大白猪单倍型、共享单倍型与琉球野猪遗传距离较近,聚集在同一分支.这也符合大白猪和长白猪是引进品种,而巴马小型猪和融水小型猪是我国自主培育的地方品种特征.本研究表明与我国地方猪品种相比,实验用SPF大白猪和长白猪种群的单倍型数较少,各存在1个优势单倍型,遗传多样性低,具有清晰的母系遗传结构.总之,SPF大白猪和长白猪mtDNAD-loop区遗传特征的分析进一步明确了其母系遗传结构,为继续对SPF大白猪和长白猪的实验动物标准化研究奠定了基础,也丰富了实验动物资源,有利于实验动物科学的研究.

关键词： SPF猪 mtDNA 控制区母系遗传结构

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肠出血性大肠杆菌强定殖株中新的双组份系统的鉴定

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畜牧与兽医 2018年第6期50卷 114-117页

作者：杨永武张昕杨张雪寒何孔旺蔡文通李干武南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 江苏省农业科学院江苏南京210014

为了比较7株肠出血性大肠杆菌O157∶H7的定殖能力,采用灌胃感染的方式,将7株肠出血性大肠杆菌分别感染小鼠。对粪便中的细菌以及盲肠内定殖的细菌进行分离、计数,发现牛源菌株C1的定殖能力最强,且定殖维持时间最长。对C1菌株的基因组序... 详细信息

为了比较7株肠出血性大肠杆菌O157∶H7的定殖能力,采用灌胃感染的方式,将7株肠出血性大肠杆菌分别感染小鼠。对粪便中的细菌以及盲肠内定殖的细菌进行分离、计数,发现牛源菌株C1的定殖能力最强,且定殖维持时间最长。对C1菌株的基因组序列分析得到1对功能未知的双组份调节系统（TCS）,N5512/N5520。PCR检测显示N5512/N5520存在于绝大多数肠出血性大肠杆菌O157∶H7临床分离株（98.5%）,而在其他致病型的大肠杆菌中没有检测到。本研究为大肠杆菌O157∶H7的定殖和致病机制研究奠定了基础。

关键词：肠出血性大肠杆菌O157:H7 抗性诱导肠道定殖双组份调节系统

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采用RNAscope原位杂交技术检测PRRSV与PCV2的共感染

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中国预防兽医学报 2018年第11期40卷 1015-1019页

作者：王晓捷崔蒙蒙常天明王刚李江南何希君刘长明熊涛翁长江长江大学生命科学学院湖北荆州434025 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 华中农业大学动物医学院湖北武汉430070

RNAscope原位杂交是一种检测细胞内靶标RNA的新型检测技术,为验证该技术能否用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒2型(PRRSV-PCV2)的共感染,本研究针对PRRSV N基因和PCV2 Rep基因序列,分别设计两组特异性探针,利用RNAscope原位杂... 详细信息

RNAscope原位杂交是一种检测细胞内靶标RNA的新型检测技术,为验证该技术能否用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒2型(PRRSV-PCV2)的共感染,本研究针对PRRSV N基因和PCV2 Rep基因序列,分别设计两组特异性探针,利用RNAscope原位杂交技术分别检测了PRRSV和PCV2单独感染或PRRSV-PCV2共感染的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)以及一例PRRSV-PCV2共感染猪的多个组织样品,同时采用间接免疫荧光试验(IFA)以及RNAscope原位杂交联合IFA对PRRSV和PCV2单独感染或PRRSV-PCV2共感染的PAMs进行检测。结果显示,通过RNAscope原位杂交技术检测PRRSV N基因和PCV2 Rep基因检测到同一PAM中的PRRSV和PCV2共感染;通过IFA检测PRRSV Nsp9蛋白和PCV2 Cap蛋白检测到同一PAM中的PRRSV和PCV2共感染;两种方法联合使用结果显示,通过RNAscope探针检测PRRSV N基因和IFA方法检测PCV2 Cap蛋白,或者通过RNAscope探针检测PCV2 Rep基因同时用IFA方法检测PRRSV Nsp9蛋白来检测同一PAM中的PRRSV和PCV2共感染。同时,RNAscope原位杂交技术能够在PRRSV-PCV2共感染猪的肺脏、脾脏和淋巴结的组织切片中检测到PRRSV和PCV2共感染的细胞。以上结果表明RNAscope原位杂交技术适用于PRRSV-PCV2共感染的细胞和组织样品的检测,为研究PRRSV-PCV2共感染及协同致病机制奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型 RNAscope 共感染

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多杀性巴氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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中国预防兽医学报 2018年第8期40卷 706-710页

作者：许腾林邢桂玲刘家森刘大飞李志杰姜骞康洪涛田进郭东春曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 东北农业大学动物科技学院黑龙江哈尔滨150069

为建立一种多杀性巴氏杆菌(Pm)快速敏感的检测方法,本实验根据Pm70株kmt1基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了该菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并优化了检测反应条件。本实验建立的荧光定量PCR方法可以特异性检测Pm,而对鸭疫... 详细信息

为建立一种多杀性巴氏杆菌(Pm)快速敏感的检测方法,本实验根据Pm70株kmt1基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了该菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并优化了检测反应条件。本实验建立的荧光定量PCR方法可以特异性检测Pm,而对鸭疫里默氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等菌株检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。该方法对C48-1株标准品的检测灵敏度为1.75×10~1拷贝/μL,优于常规PCR检测方法(1.75×10~3拷贝/μL) 100倍;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性。对20份疑似感染的临床病料样品(鸡肝脏、牛肺脏)进行增菌培养和分离鉴定,结果分离到8株多杀性巴氏杆菌;以建立的荧光定量PCR方法与常规PCR方法对增菌培养液进行检测,阳性率分别为40%(8/20)和25%(5/20),且荧光定量PCR方法与常规细菌分离鉴定的符合率为100%。对C48-1株感染致死的20份小鼠肝脏和脾脏组织研磨液进行检测,阳性率均为100%。本研究建立的方法能够快速、敏感的检测Pm,对于其临床和实验室的快速诊断具有重要意义。

关键词：多杀性巴氏杆菌 TaqMan探针荧光定量PCR

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内质网应激抑制冠状病毒TGEV复制的分子机制研究

内质网应激抑制冠状病毒TGEV复制的分子机制研究

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中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第六次学术研讨会

作者：薛美符芳马艳龙张鑫李亮冯力刘平黄中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)属于alpha冠状病毒家族成员,其感染导致新生仔猪的水泻和脱水,是引起规模化养猪场新生仔猪腹泻性死亡的重要原因,给我国养猪业造成了严重的经济损失。冠状病毒的复制与细胞... 详细信息

传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)属于alpha冠状病毒家族成员,其感染导致新生仔猪的水泻和脱水,是引起规模化养猪场新生仔猪腹泻性死亡的重要原因,给我国养猪业造成了严重的经济损失。冠状病毒的复制与细胞内质网(ER)密切相关。内质网作为蛋白质折叠和翻译后修饰的重要场所,是病毒复制和成熟的必需细胞器。病毒感染后,细胞内合成大量的病毒蛋白,从而增加内质网的负担,进而增加了未折叠蛋白和错误折叠蛋白的堆积。因此,病毒感染后通常会诱发内质网应激。然而,病毒诱导的内质网应激如何影响病毒复制和调节宿主对病毒感染的天然免疫应答仍未完全清楚。本研究表明,TGEV感染在体外和体内能够诱导内质网应激和激化内质网应激未折叠的蛋白质反应(the unfolded protein response,UPR),内质网应激抑制TGEV复制。尽管TGEV感染激活了所有三种UPR途径(ATF6,IRE1和PERK)。通过siRNA基因静默、特异性抑制剂或过表达基因功能试验表明,病毒触发的内质网应激抑制TGEV复制主要通过激活PERK,激活的PERK导致磷酸化eIF2α并激活其下游信号通路。PERK-eIF2α信号通路制剂TGEV复制通过磷酸化的eIF2α介导的抑制总体蛋白质翻译。除了通过下调蛋白翻译直接抑制病毒产生之外,PERK-eIF2α途径激活NF-κB,然后促进I型IFN产生,导致TGEV抑制。总之,我们的研究结果表明,冠状病毒TGEV感染诱发的PERK-eIF2α通路负调控TGEV复制,并且通过调控宿主的天然免疫应答来影响病毒复制。该研究阐明了内质网应激抑制TGEV复制的分子机制,为研发抗冠状病毒药物靶点和制定抗病毒新策略提供了重要理论依据。

关键词：内质网应激未折叠蛋白反应蛋白激酶R样ER激酶传染性胃肠炎病毒干扰素

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弓形虫氨基肽酶的协同作用及功能性特征

弓形虫氨基肽酶的协同作用及功能性特征

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第十一届全国寄生虫学青年工作者学术研讨会

作者：郑君曹世诺张朝霞贾洪林中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

近年来,氨基肽酶作为一种有效的药物靶位已经在很多抗寄生虫药物的研究中得到了应用,其中,M1、M17以及M18家族的天冬氨酰氨基肽酶就作为理想的药物靶点应用到了抗疟原虫的药物研究中。弓形虫与疟原虫同属于顶复门原虫,在弓形虫的基因组... 详细信息

近年来,氨基肽酶作为一种有效的药物靶位已经在很多抗寄生虫药物的研究中得到了应用,其中,M1、M17以及M18家族的天冬氨酰氨基肽酶就作为理想的药物靶点应用到了抗疟原虫的药物研究中。弓形虫与疟原虫同属于顶复门原虫,在弓形虫的基因组中存在着10个氨基肽酶的同源编码基因,这些基因在

关键词：弓形虫氨基肽酶特异性底物功能性特征

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一株血清31型猪链球菌的分离鉴定及生物学特性研究

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中国预防兽医学报 2018年第4期40卷 347-349页

作者：王淑杰段贵鑫刘永刚何海娟姜成刚王刚涂亚斌蔡雪辉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/流行病学与病原监测研究创新团队黑龙江哈尔滨150069 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163000 黑龙江省农业科学院畜牧研究所黑龙江哈尔滨150086

为了检测2015年12月黑龙江省萝北市某猪场2只发病猪的病原,本研究将发病猪迫杀后无菌采集的脑组织于血平板培养基上划线进行细菌分离培养,结果显示在血平板培养基上形成灰白色、半透明、边缘整齐的带有草绿色狭窄溶血环的光滑型圆形小菌... 详细信息

为了检测2015年12月黑龙江省萝北市某猪场2只发病猪的病原,本研究将发病猪迫杀后无菌采集的脑组织于血平板培养基上划线进行细菌分离培养,结果显示在血平板培养基上形成灰白色、半透明、边缘整齐的带有草绿色狭窄溶血环的光滑型圆形小菌落,初步鉴定为革兰氏阳性双球及短链球菌。经猪链球菌(***)种PCR鉴定及血清凝集试验分型鉴定该菌为***血清31型,其毒力基因型为gdh+、mrp-、ef-、sly-、89KPaI-,将其命名为15LB12株。经MLST分型分析,其等位基因图谱为1、35、2、7、1、52、28,经与ST型数据库比对,显示其为ST421。小鼠致病性试验显示,该***可导致小鼠发病及死亡,死亡率为12.5%,并且其可突破血脑屏障引起化脓性脑炎。本研究为了解***的遗传多样性、微进化和毒力提供了新的数据。

关键词：猪链球菌血清型分离鉴定 ST分型

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鸭坦布苏病毒E蛋白特异性抗原表位鉴定及Epitope-ELISA血清学诊断方法建立

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畜牧兽医学报 2017年第10期48卷 1958-1968页

作者：李晨曦白小飞邵周伍林张青山刘明张云中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

旨在建立鸭坦布苏病毒(DTMUV)的特异性血清学诊断方法。本研究以纯化的单克隆抗体1A5为固相筛选分子,利用噬菌体展示技术鉴定DTMUV囊膜(E)蛋白的特异性抗原表位,并利用DNAStar分析抗原表位序列在DTMUV中保守性和与其他黄病毒的E蛋白相... 详细信息

旨在建立鸭坦布苏病毒(DTMUV)的特异性血清学诊断方法。本研究以纯化的单克隆抗体1A5为固相筛选分子,利用噬菌体展示技术鉴定DTMUV囊膜(E)蛋白的特异性抗原表位,并利用DNAStar分析抗原表位序列在DTMUV中保守性和与其他黄病毒的E蛋白相应位点的氨基酸序列相似性。结果成功筛选到DTMUV E蛋白的一个线性抗原表位_(87)YAEYI_(91),该抗原表位在DTMUV中具有高度的保守性,无氨基酸位点差异,而与其他黄病毒E蛋白相应位点的氨基酸序列不具有相似性。Dot-Blotting结果表明表位_(87)YAEYI_(91)与DTMUV阳性血清具有良好的亲和性,而与JEV、DENV、WNV等黄病毒阳性血清间不出现交叉反应,可见抗原表位_(87)YAEYI_(91)为DTMUV所特有的抗原表位。利用DTMUV特异性抗原表位87YAEYI_(91)建立Epitope-ELISA血清学诊断方法并对126份鸭血清样品进行检测,以中和试验作为标准进行比较,结果显示Epitope-ELISA检测方法的相对特异性为100%,相对敏感度为96%,并且Epitope-ELISA与其他黄病毒血清间不出现交叉反应性,表明本研究建立的Epitope-ELISA检测方法是一种特异的、灵敏的ELISA血清学诊断方法。

关键词：鸭坦布苏病毒抗原表位交叉反应性 Epitope-ELISA

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水貂阿留申病诊断技术的进展

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中国兽医杂志 2018年第11期54卷 58-60页

作者：李俚胡哲孙金辉关东嵩方孟颀王晓钧路义鑫东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 哈尔滨海关黑龙江哈尔滨150028 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 大庆海关黑龙江大庆163311

水貂阿留申病(AMD)是由水貂阿留申病毒(AMDV)引起的一种能够引起自身免疫紊乱的慢性进行性传染病。引起该病的病毒可感染各个年龄段的水貂,依据感染毒株类型的不同,病症呈多样性。对新生仔貂而言,AMDV引起的死亡率几乎可达到100%;而对... 详细信息

水貂阿留申病(AMD)是由水貂阿留申病毒(AMDV)引起的一种能够引起自身免疫紊乱的慢性进行性传染病。引起该病的病毒可感染各个年龄段的水貂,依据感染毒株类型的不同,病症呈多样性。对新生仔貂而言,AMDV引起的死亡率几乎可达到100%;而对于成年水貂,该病通常引起水貂的持续感染,并表现为终生病毒血症、高蛋白血症、动脉血管炎和由病毒抗体复合体诱导的肾小球肾炎及肝炎等。临床上还没有能够防治AMD的有效疫苗和药物,因此目前防控该病的手段主要为水貂新引入前的检疫、场址的彻底消毒,以及感染貂群中病畜的扑杀。大多数情况下,水貂感染AMD后没有典型的临床症状,确诊主要依赖于实验室的检测。本文对近年来国内外AMD的主要诊断方法及特点进行综述,以期为新水貂引入前的检疫、环境消毒效果的评价及感染貂场AMD的防控提供方法依据。

关键词：水貂阿留申病诊断技术持续感染阿留申病毒病毒血症临床症状消毒效果肾小球肾炎

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抗猪SIgA SC片段单克隆抗体的制备及鉴定

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中国预防兽医学报 2018年第5期40卷 455-458页

作者：高冉刘建波陈建飞时洪艳张鑫石达曹丽艳董素凤冯力黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪消化道团队黑龙江哈尔滨150069 辽宁省重大动物疫病应急中心辽宁沈阳110161

为获得抗猪分泌型IgA(SIgA)的单克隆抗体(MAb),本研究以纯化的SIgA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出1株稳定分泌抗SIgA SC片段的杂交瘤细胞株,命名为2F9。MAb亚类鉴定结果显示其亚类为IgG1... 详细信息

为获得抗猪分泌型IgA(SIgA)的单克隆抗体(MAb),本研究以纯化的SIgA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出1株稳定分泌抗SIgA SC片段的杂交瘤细胞株,命名为2F9。MAb亚类鉴定结果显示其亚类为IgG1/κ链。杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为1∶200和1∶16 000。Western blot鉴定显示该MAb能够识别天然SIgA蛋白;IFA显示该MAb可以识别真核细胞表达的SIgA SC蛋白。抗猪SIgA SC片段的MAb制备,为建立一系列猪消化道病原的特异性SIgA诊断方法及研究黏膜免疫提供了重要工具,具有广阔的应用前景。

关键词： SIgA 单克隆抗体 SC片段

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