检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2025年第2期47卷 117-123页

作者：赵志国田井满李明慧白晓利宋兴栋李雁冰陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

2023年5月本实验室从家禽的监测样品中分离到一株H5N6亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV),命名为A/chicken/Jiangsu/S1/2023(H5N6)株,简称CK/JS/S1/2023(H5N6)株。为进一步了解该病毒的生物学特性,本研究对其进行全基因组的分段PCR扩增与测... 详细信息

2023年5月本实验室从家禽的监测样品中分离到一株H5N6亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV),命名为A/chicken/Jiangsu/S1/2023(H5N6)株,简称CK/JS/S1/2023(H5N6)株。为进一步了解该病毒的生物学特性,本研究对其进行全基因组的分段PCR扩增与测序分析各基因节段编码的关键氨基酸位点及各基因节段的遗传演化分析,采用Simplot软件分析该病毒全基因组的重配事件,采用交叉血凝抑制试验分析该病毒的抗原性。结果显示,该病毒HA蛋白的裂解位点为PLRERRRKR↓GLF,符合HPAIV的分子特征。关键氨基酸位点分析显示HA蛋白受体结合区域出现S^(133)A和T^(156)A增强病毒与人型受体(α2,6)结合能力的突变;NA蛋白颈部出现了aa59~aa69的缺失;PB1蛋白的D622G、M1蛋白的^(I43)M和T^(215)A及NS1蛋白的I106M,这些位点的突变均可以增强病毒对哺乳动物的致病性。遗传演化分析结果显示,该病毒HA基因属于2.3.4.4b亚分支,NA基因及5个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M)均属于欧亚分支,NS基因属于等位基因A分支(Allele A)。基因重配分析结果显示该病毒是由野鸟源的H5N8和家鸭源的H5N6、H4N6和H3N2AIV形成的一株多元重配病毒。抗原性分析结果显示,该病毒与2.3.4.4b亚分支H5-Re14疫苗株抗原性相匹配。将该病毒以10~1EID_(50)/50μL~10~6EID_(50)/50μL剂量经鼻腔感染小鼠,通过小鼠的存活率和各脏器病毒滴度分析该病毒的致病性。结果显示,感染组小鼠均出现精神沉郁、被毛凌乱、体质量下降等症状,感染该病毒后第4 d开始出现死亡。经计算该病毒对小鼠的半数致死量(MLD_(50))为1.5 log_(10)EID_(50),呈高致病性(MLD_(50)<3 log_(10)EID_(50))。该病毒不经提前适应即可在小鼠的多脏器中有效复制,其在肺脏中的病毒滴度最高,达到7.25 log_(10)EID_(50)/m L。本研究通过对H5N6亚型HPAIV的部分生物学特性研究,为2.3.4.4b亚分支H5亚型HPAI的防控提供数据支持与借鉴。

关键词： H5N6亚型高致病性禽流感病毒分子特征遗传演化抗原性哺乳动物致病性

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A型流感病毒PB2蛋白帽子结合结构域的原核表达与鉴定

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中国预防兽医学报 2024年第2期46卷 107-112,139页

作者：林维鹏崔鹏飞王思文邓国华陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源... 详细信息

A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源重组策略将8×His标签与一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的CBD区基因序列克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-8×His-CBD,经PCR及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度IPTG诱导不同时间后,经SDS-PAGE检测蛋白表达后使用镍柱纯化。结果显示,菌体裂解上清中在21 ku处可见目的条带,与8×His-CBD蛋白预期大小符合,且以0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h时蛋白表达量最高,镍柱纯化后可获得纯度大于95%的8×His-CBD蛋白。为确定该蛋白是否具有生物学活性,本研究以帽子结构类似物m7GTP对其进行等温滴定量热试验,结果显示8×His-CBD蛋白和m~7GTP结合时存在明显热峰,表明8×His-CBD蛋白具有生物学活性;经计算,其Kd值为1.71×10^(-5)(±2.92×10^(-6))mol/L。本研究结果对流感病毒的基础研究和抗流感病毒药物的研发具有借鉴意义。

关键词： A型流感病毒 PB2蛋白帽子结合结构域原核表达纯化

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DBNL蛋白影响A型流感病毒复制机制的研究

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中国预防兽医学报 2023年第11期45卷 1095-1100页

作者：孟德锦李奇兵胡玉珍王一涵王波石文军单智博姜丽陈化兰李呈军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

A型流感病毒(IAV)在宿主细胞内复制过程中需要许多宿主因子的参与,同时IAV也能调控多种宿主因子的表达。为寻找调控IAV复制的宿主因子,本研究通过SDS-PAGE电泳检测发现H1N1亚型流感病毒A/WSN/1933株(简写为WSN)感染A549细胞会上调表达55... 详细信息

A型流感病毒(IAV)在宿主细胞内复制过程中需要许多宿主因子的参与,同时IAV也能调控多种宿主因子的表达。为寻找调控IAV复制的宿主因子,本研究通过SDS-PAGE电泳检测发现H1N1亚型流感病毒A/WSN/1933株(简写为WSN)感染A549细胞会上调表达55 ku左右的特异蛋白条带(感染后9 h),将该55 ku左右的蛋白条带切胶回收后进行质谱分析,根据质谱分析的筛选标准选择蛋白得分(Mass score)较高、谱图数(Matches)和序列数(Sequences)较为可信的宿主因子DBNL作为调控IAV复制的潜在研究对象进一步研究。本研究针对DBNL设计特异的siRNA和对照Scrambled siRNA,将其分别转染A549细胞,通过荧光定量PCR确定DBNL siRNA在转录水平的干扰效果显著;利用细胞活力测定试验确定DBNL siRNA的干扰不影响细胞活力。利用DBNL siRNA下调表达A549细胞中的DBNL后,以WSN感染该细胞,在感染后24 h、48 h分别收集细胞上清,利用MDCK细胞进行噬斑滴定试验。试验结果显示,与对照组相比,下调表达DBNL后IAV的滴度极显著降低(P<0.01),表明下调表达DBNL能够抑制A549细胞中的IAV复制。利用siRNA下调表达A549细胞中的DBNL后,以WSN感染A549细胞,采用激光共聚焦试验鉴定IAV NP蛋白的表达与定位情况。结果显示,在病毒感染后6 h,对照组中红色荧光集中分布在细胞质中,而DBNL siRNA组中红色荧光在细胞核与细胞质中均有分布,表明下调表达DBNL能够抑制细胞中IAV NP蛋白的出核。反之,通过转染过表达DBNL的重组质粒,以WSN感染A549细胞,采用激光共聚焦试验鉴定IAV NP蛋白的表达与定位情况。结果显示,在病毒感染后4 h,转染pCAGGS的对照组中红色荧光主要分布在细胞核中,而过表达DBNL组中的红色荧光在细胞核与细胞质中均有分布,表明过表达DBNL能够促进细胞中IAV NP蛋白的出核。以上研究结果证实DBNL正调控IAV的复制与其NP蛋白的出核。本研究丰富了DBNL功能的多样性,为宿主因子调控IAV复制的研究提供参考数据。

关键词：流感病毒 DBNL蛋白 NP蛋白

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一株野鸟源H5N8高致病性禽流感病毒的遗传演化分析及生物学特性研究

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中国预防兽医学报 2023年第5期45卷 445-451页

作者：白晓利李明慧田井满宋兴栋刘丽娜李雁冰陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

2021年本实验室从发病野鸟组织样品中分离到一株H5N8亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/black-headed gull/Tibet/1-2/2021(H5N8),简称为BH Gull/TB/1-2/2021(H5N8)。为进一步了解该病毒的生物学特性,本研究对其基因组测序并经遗传演化分析,... 详细信息

2021年本实验室从发病野鸟组织样品中分离到一株H5N8亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/black-headed gull/Tibet/1-2/2021(H5N8),简称为BH Gull/TB/1-2/2021(H5N8)。为进一步了解该病毒的生物学特性,本研究对其基因组测序并经遗传演化分析,结果显示,该病毒HA蛋白的裂解位点为PLREKRRKR↓GLF,符合高致病性AIV(HPAIV)的分子特征。在遗传进化上HA基因属于2.3.4.4b分支,外部基因与部分内部基因(PB1、PA、NP、NS)均与2020年~2021年分离到的H5N8亚型AIV相应基因的同源性最高,且处于同一分支;PB2基因与一株H9N2亚型AIV PB2基因同源性最高,为99.25%;M基因与近两年流行的2.3.4.4b分支H5N1亚型AIV同源性最高,且处于同一分支,推测该病毒为一株重组病毒。抗原性分析结果显示,该病毒与2.3.4.4分支H5-Re8、2.3.4.4b分支H5-Re14疫苗株抗原性相近。不同哺乳动物细胞系生长曲线结果显示,该病毒可在哺乳动物细胞系中有效复制,但其在A549中的复制效率高于其在MDCK及293T细胞中的复制效率。BALB/c小鼠感染实验结果显示,该病毒不经提前适应即可在小鼠的多脏器中有效复制,对小鼠的半数致死量(MLD50)为0.98log10EID50,对小鼠呈高致病性。本研究结果对H5亚型HPAI的综合防控和公共安全预警具有借鉴意义。

关键词： H5N8 高致病性禽流感遗传演化分析抗原性分析哺乳动物致病性

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一株欧亚类禽H1N1亚型猪流感病毒的遗传进化分析及其对小鼠的致病力研究

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中国预防兽医学报 2023年第6期45卷 553-558页

作者：刘雅茹宋祖晨孟飞黄凯伦王飞飞陈艳陈化兰杨焕良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

猪流感病毒(SIV)是一种重要的人兽共患病毒,不仅对养猪业造成重大的经济损失,也对其他哺乳动物和人类有潜在感染风险。本研究团队前期对山东猪群常规流行病学调查时分离到一株H1N1亚型SIV,简称SW/SD/260/2021株,为了解该SIV的生物学特... 详细信息

猪流感病毒(SIV)是一种重要的人兽共患病毒,不仅对养猪业造成重大的经济损失,也对其他哺乳动物和人类有潜在感染风险。本研究团队前期对山东猪群常规流行病学调查时分离到一株H1N1亚型SIV,简称SW/SD/260/2021株,为了解该SIV的生物学特征和其对小鼠的致病性,本研究利用鸡胚对病毒纯化传代后,采用Reed-Muench方法测定SIV SW/SD/260/2021株EID50、TCID50,对其全基因组测序并分析其同源性。采用MEGA7.0中的邻接法构建HA和NA基因的进化树。进一步将该SIV以106 EID50/只滴鼻感染小鼠,于感染后3 d剖杀各组小鼠,采集各脏器组织,检测其体内病毒的复制情况,剩余小鼠在14 d内观察临床症状、记录体质量等,评价该SIV对哺乳动物的致病性。结果显示,该病毒株经纯化后EID50为107.25/0.1 mL,TCID50为105.67/0.1 mL;全基因组序列的BLAST比对结果显示,该病毒株的8个节段与来自辽宁、天津、Oman(阿曼苏丹)、江苏等多地不同年份的H1N1猪或人流感病毒高度同源。小鼠致病性试验结果显示,该病毒在小鼠的鼻甲和肺中呈高水平复制,病毒滴度均达104 EID50以上;感染组小鼠出现精神沉郁、被毛凌乱、食欲减退、体质量快速下降等症状,并于感染后第4 d全部死亡。本研究对欧亚类禽H1N1亚型SIV的序列进行分析,阐明了该病毒的基因遗传演化、分子特征和致病性,并揭示了欧亚类禽H1N1亚型SIV的跨种传播风险,为我国SIV的监测和SI的防控提供参考依据。

关键词：猪流感病毒 H1N1 进化分析致病力

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一株H1N1亚型猪流感病毒的遗传演化分析及在雪貂体内复制和飞沫传播能力评估

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中国预防兽医学报 2023年第10期45卷 987-993页

作者：张奕杰孟飞杨焕良宋祖晨陈艳陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

本实验室于2016年在天津分离到一株猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Tianjin/312/2016(H1N1)(简称为TJ312株)。为了解该株病毒的生物学特性及遗传演化特征,本研究对经PCR分段扩增该病毒全基因组并测序,采用SeqMan软件拼接成全基因组序列... 详细信息

本实验室于2016年在天津分离到一株猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Tianjin/312/2016(H1N1)(简称为TJ312株)。为了解该株病毒的生物学特性及遗传演化特征,本研究对经PCR分段扩增该病毒全基因组并测序,采用SeqMan软件拼接成全基因组序列经BLAST比对,得到与该SIV各基因节段序列同源性最高的病毒株,采用mafft分析其各基因节段编码氨基酸序列的分子特征,利用MEGA5.1软件分别构建该病毒8个基因节段的进化树。结果显示,SIV TJ312株各基因节段与2016年分离自天津的H1N1 SIV相应各基因节段的同源性在99%~100%。进化树结果显示该病毒株HA、NA和M基因均来自欧亚类禽H1N1(EA H1N1)SIV谱系;PB2、PB1、PA和NP基因来自2009/H1N1流感病毒谱系;NS基因来自北美三重配H1N2 SIV谱系。蛋白分子特征分析结果显示,HA蛋白碱性氨基酸裂解位点序列为PSIQSR↓G,符合低致病性流感病毒分子特征;受体结合位点符合人源唾液酸受体(α-2,6唾液酸受体)的分子特性;NA蛋白aa275为H、aa295为N,且该蛋白头部区域未缺失,表明该病毒对奥司他韦类药物敏感;PA蛋白^(356)R为病毒复制增强和对哺乳动物致病性增强的分子特征;NP蛋白存在^(41)I以及^(210)E病毒聚合酶活性增强的分子特征;M2蛋白的^(31)N表示该SIV对金刚烷胺类药物耐药。将该病毒以10^(6) EID_(50)/只经鼻腔感染2只雪貂,感染后96 h剖杀,采集各脏器组织观察其剖检病变并对出现病变的肺脏制备病理切片观察其组织病变,采用免疫组化试验检测肺脏组织中的病毒抗原。将采集的所有脏器处理后接种鸡胚检测脏器内的病毒滴度评估该病毒在雪貂体内的复制能力;将该株病毒以上述剂量经鼻腔感染3只雪貂分别放入3个铁笼内作为感染组,24 h后在相邻3个铁笼内分别放入1只未感染雪貂作为传播组。所有雪貂自感染组接种病毒后2 d起,隔天采集鼻洗液至第14 d,通过检测雪貂鼻洗液内的病毒滴度与感染后21 d血清HI抗体效价评估病毒在雪貂间的飞沫传播能力。结果显示,TJ312株感染后引起雪貂肺脏明显的剖检病变,其余脏器均无肉眼可见病变。肺脏病理切片及免疫组化结果显示,肺脏组织出现了一定的病理损伤,且支气管上皮细胞中出现大量棕黄色和深棕色颗粒,即检测到了病毒抗原。病毒滴定结果显示,TJ312株在雪貂呼吸道内复制良好,在其鼻甲中复制能力最强,平均病毒滴度6.13 log_(10)EID_(50)/mL,在其肺右下叶中的复制能力次之,平均病毒滴度可达6 log_(10)EID_(50)/mL。在脾脏、肾脏、肝脏中均未检出病毒。但在1只雪貂的脑中检出微量病毒,滴度为0.63 log_(10)EID_(50)/mL。飞沫传播试验中,感染组3只雪貂的鼻洗液中均检测到高滴度的病毒,病毒滴度最高达5.50 Log_(10)EID_(50)/mL,血清中均检测到了高水平的HI抗体效价(1∶1280、1∶1280、1∶2560);传播组3只雪貂中有1只鼻洗液病毒滴定结果呈阳性(最高达5.75 Log_(10)EID_(50)/mL)且其血清中检出较高的HI抗体效价(1∶2560)。上述结果表明,TJ312株可能是由2016年天津其他H1N1 SIV间的基因节段重组而来,且该株病毒存在部分耐药性及对哺乳动物致病性增强的氨基酸分子特征。病毒在雪貂的呼吸道中复制水平较高并对其肺脏造成损害,且可以通过飞沫在雪貂间传播。本研究为进一步了解EA H1N1 SIV的生物学特性及探究其感染机制提供一定的参考依据。

关键词：猪流感病毒欧亚类禽H1N1 遗传演化飞沫传播

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野鸟源H8N2亚型禽流感病毒的生物学特性分析

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中国预防兽医学报 2022年第6期44卷 577-582页

作者：田井满李明慧白晓利李玉磊刘丽娜李雁冰陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

本研究团队于2019年在常规主动监测野鸟源禽流感病毒(AIV)时,于山东省荣成市分离到一株H8N2亚型AIV,为了解该株H8N2亚型AIV的生物学特性,本研究对其全基因组进行了测序及遗传演化分析。结果显示,该病毒HA和NA基因分别来自鸭源H8N4和H9N... 详细信息

本研究团队于2019年在常规主动监测野鸟源禽流感病毒(AIV)时,于山东省荣成市分离到一株H8N2亚型AIV,为了解该株H8N2亚型AIV的生物学特性,本研究对其全基因组进行了测序及遗传演化分析。结果显示,该病毒HA和NA基因分别来自鸭源H8N4和H9N2亚型AIV,其部分内部基因来源于野鸟源AIV,而且该H8N2亚型AIV的PB2基因起源于北美,表明该H8N2亚型AIV是一株跨大陆、跨物种、多亚型的重组AIV。关键氨基酸位点分析显示,其HA蛋白碱性裂解位点氨基酸序列为SIEPK/GLF,为低致病AIV分子标志;PB1蛋白出现D622G突变,NS1蛋白存在P^(42)S、I^(106)M、C^(138)F突变,提示其具有增强对哺乳动物致病性的潜在能力。采用该H8N2亚型AIV感染SPF鸡后采集各脏器及拭子样品,接种鸡胚后通过病毒滴定试验检测,结果显示,该病毒不能通过SPF鸡的喉头或泄殖腔排毒,且在感染鸡各脏器中均未检测到该病毒的有效复制。进一步采用该病毒感染BALB/c小鼠后观察临床症状,并采集各脏器后利用普通鸡胚进行脏器病毒滴定试验,结果显示,小鼠感染病毒后无明显临床症状和体质量下降。该H8N2亚型AIV虽不致死小鼠,但在其肺脏、鼻甲、肾脏以及脾脏均可有效复制。本研究对该H8N2亚型AIV的部分生物学特性进行了探究,为H8N2亚型AI的综合防控提供参考依据。

关键词：禽流感病毒 H8N2 野鸟跨大陆重组跨种感染

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鸭肠炎病毒疫苗株UL41和UL40基因间隔区作为其复制非必需区的鉴定

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中国预防兽医学报 2022年第9期44卷 996-1000页

作者：刘静赵玉博焦晨晨陈普成胡玉珍姜永萍陈化兰柳金雄中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

为探寻鸭肠炎病毒(DEV)基因组中可插入外源基因的复制非必需区,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建重组质粒pX459-ul4140和含有红色荧光蛋白(RFP)表达框架的穿梭片段UL41-RFP-UL40,转染后拯救重组病毒,并对其进行噬斑纯化。通过PC... 详细信息

为探寻鸭肠炎病毒(DEV)基因组中可插入外源基因的复制非必需区,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建重组质粒pX459-ul4140和含有红色荧光蛋白(RFP)表达框架的穿梭片段UL41-RFP-UL40,转染后拯救重组病毒,并对其进行噬斑纯化。通过PCR和荧光显微镜观察对重组病毒进行鉴定,结果显示,经拯救得到表达RFP的重组病毒rDEV-ul4140RFP;所有代次的rDEV-ul4140RFP在显微镜下均能观察到红色荧光,表明重组病毒中的RFP基因稳定存在。将rDEV-ul4140RFP和亲本病毒DEV疫苗株接种鸡胚成纤维细胞(CEFs)后,收集24 h、48 h、72 h、96 h的细胞和上清,检测TCID并绘制生长曲线。结果显示,rDEV-ul4140RFP在CEF中的生长曲线和亲本DEV疫苗株无显著差异。利用SPF鸭对rDEV-ul4140RFP的免疫保护效果进行评价。攻毒保护实验结果显示,rDEV-ul4140RFP和亲本病毒DEV疫苗株均能对SPF鸭提供100%的免疫保护。本研究结果证实DEV基因组UL41和UL40基因间隔区可作为外源基因的插入位点,为以DEV为载体构建相关重组疫苗提供参考依据。

关键词：鸭肠炎病毒 CRISPR/Cas9 复制非必需区

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一株新型重配H9N8亚型禽流感病毒的分子进化分析及其对小鼠的感染性研究

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中国预防兽医学报 2022年第7期44卷 691-696页

作者：颜成崔鹏飞邢鑫谷文丽张元成衡武昌王丛丛邓国华陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

2020年5月,本实验室在对禽流感常规监测时从广西一鸭场分离到一株H9N8亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/duck/Guangxi/S10590/2020(H9N8)(简称DK/GX/S10590/2020)。为了解该H9N8分离株的生物学特性和公共卫生风险,本研究对其进行了全基因组... 详细信息

2020年5月,本实验室在对禽流感常规监测时从广西一鸭场分离到一株H9N8亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/duck/Guangxi/S10590/2020(H9N8)(简称DK/GX/S10590/2020)。为了解该H9N8分离株的生物学特性和公共卫生风险,本研究对其进行了全基因组序列及遗传演化分析,并采用贝叶斯端点定年法进行进化分析;进一步以小鼠为动物模型,评价该AIV对哺乳动物的感染性。全基因组序列经BLAST比对,结果显示,该病毒株与H1N1、H3N8、H4N8、H6N1、H7N3、H7N7和H9N2等多种亚型野鸟源低致病性AIV(LPAIV)具有较高同源性,提示其可能是由多种LPAIV在病毒传播过程中经过复杂重配而形成。遗传演化及贝叶斯进化分析结果显示,该病毒可能在2018年末重配产生,后由东亚-澳大利西亚迁徙线上的野鸟引入广西鸭群。特殊氨基酸位点分析结果显示,该病毒HA蛋白裂解位点为PAASNR/GL,仅含有一个碱性氨基酸,且其HA蛋白具有T分子特征,进一步表明该AIV为LPAIV,且具有结合人型唾液酸受体的潜在能力;此外,在内部基因表达蛋白中发现了PB1蛋白的LP、PB1-F2蛋白的LS、PA蛋白的KE和VD、NP蛋白的VM和KQ、以及M1蛋白的HY和AV等多个可增强H9亚型AIV对鸡或哺乳动物组织嗜性的突变,表明该病毒株具有潜在感染鸡和哺乳动物的风险。小鼠感染性试验结果显示,该病毒仅在小鼠鼻甲中低水平复制,对小鼠呈低致病力。本研究为H9亚型AIV的监测和流行病学评估提供了数据支持。

关键词：禽流感病毒 H9N8 重配感染性

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TRIM74对流感病毒复制机制影响的研究

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中国预防兽医学报 2022年第10期44卷 1025-1033页

作者：叶苗苗孙楠李奇兵石文军王波王广文姜丽陈化兰李呈军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室/农业农村部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

为探究三方基序蛋白74(TRIM74)对流感病毒复制的影响,本研究设计并合成靶向TRIM74基因的siRNA,即siTRIM74-331,将其转染A549细胞后,利用荧光定量PCR检测siTRIM74-331对细胞中TRIM74转录水平的干扰效率,利用细胞活力检测试剂盒检测该siRN... 详细信息

为探究三方基序蛋白74(TRIM74)对流感病毒复制的影响,本研究设计并合成靶向TRIM74基因的siRNA,即siTRIM74-331,将其转染A549细胞后,利用荧光定量PCR检测siTRIM74-331对细胞中TRIM74转录水平的干扰效率,利用细胞活力检测试剂盒检测该siRNA对细胞活力的影响。结果表明siTRIM74-331的干扰效率较好且不影响细胞活力。将siTRIM74-331转染A549细胞后感染禽流感病毒(AIV)A/WSN/1933株(WSN),并于感染后24 h、48 h分别进行噬斑滴定,结果显示干扰TRIM74的表达可抑制流感病毒的复制。利用慢病毒包装系统构建TRIM74过表达细胞系(A549-pLVX-TRIM74)和对照细胞系(A549-pLVX),并经qPCR及western blot鉴定正确后,将WSN株(MOI 0.01)分别感染上述两种细胞,并于感染后24 h、48 h收集细胞上清分别进行噬斑滴定。结果表明,过表达TRIM74能够显著促进流感病毒的复制。将WSN株(MOI 5)分别感染A549细胞和HEK293T细胞后,分别采用qPCR和western blot检测细胞中内源TRIM74的转录及蛋白表达水平,结果表明WSN能够刺激细胞内源TRIM74的转录与表达,推测宿主细胞可能通过增强TRIM74的表达响应流感病毒的感染。为探究TRIM74在宿主细胞天然免疫反应中发挥的作用,将不同剂量的表达质粒pTRIM74-V5转染HEK293T细胞,经western blot确定其能够在细胞中呈剂量依赖性表达后,将上述剂量的p TRIM74-V5与p RL-TK、pIFN-β-Luc报告质粒共转染HEK293T细胞(1组);同时将上述剂量的pTRIM74-V5与p RL-TK、pISRE-Luc报告质粒共转染HEK293T(2组),24 h后感染仙台病毒(SeV),12 h后采用双荧光素酶试验检测过表达TRIM74对IFN-β和ISRE启动子活性的影响。结果显示,转染空载体的对照细胞在感染SeV后上述两种启动子的活性均升高,而1组和2组细胞中该两种启动子的活性均极显著下降,且随pTRIM74-V5转染量的升高二者的活性均呈下降趋势。分别将SeV和poly(I:C)刺激TRIM74过表达及干扰其表达的HEK293T细胞,12 h后采用q PCR分别检测各组细胞中IFN-β和ISG56 mRNA的转录水平。结果显示,TRIM74过表达的各组细胞中IFN-β及ISG56 mRNA的转录水平均显著高于未刺激的Mock组细胞,且均极显著低于转染空载体的阴性对照细胞;干扰TRIM74表达的各组细胞中IFN-β及ISG56 mRNA的转录水平均显著高于未刺激的Mock组细胞,且均极显著或者显著高于转染NC siRNA的阴性对照细胞,表明TRIM74能够负调控细胞中相应干扰素的分泌。本研究结果首次表明TRIM74能够促进流感病毒的复制,并负调控宿主细胞中IFN-β信号通路,该研究丰富了流感病毒与宿主因子间的调控网络,为深入了解TRIM74蛋白的功能奠定了实验基础。

关键词： TRIM74 流感病毒干扰素

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