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第六届中国牛业发展大会

作者：刘喜冬王延晖李俊雅高会江许尚忠中国农业科学院北京畜牧兽医研究所中国农业科学院肉牛研究中心农业部畜禽遗传资源与利用重点开放实验室北京 100193 东北农业大学动物科技学院哈尔滨 150030 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所中国农业科学院肉牛研究中心农业部畜禽遗传资源与利用重点开放实验室北京 100193

对畜禽存栏量的调查是农业统计调查的重要内容之一，其统计调查方法主要是抽样调查。本研究旨在通过实例抽样调查，拟出合适的抽样方法对全国的基础母牛存栏量进行调查估计。采用二阶PPS(sampling with probability proportional to si... 详细信息

对畜禽存栏量的调查是农业统计调查的重要内容之一，其统计调查方法主要是抽样调查。本研究旨在通过实例抽样调查，拟出合适的抽样方法对全国的基础母牛存栏量进行调查估计。采用二阶PPS(sampling with probability proportional to size)抽样、分层等比例抽样、分层二阶典型抽样对内蒙古敖汉旗肉牛存栏量进行调查，比较三种方法的准确度。结果表明，在此三种方法10%的样本量下进行比较时，三种抽样方法按相对误差大小顺序排列为：分层二阶典型抽样＜分层等比例抽样＜二阶PPS抽样，其相对误差分层二阶典型抽样比分层等比例抽样、二阶PPS抽样分别小6.28、53.35个百分点;置信区间按大小顺序排列为：分层二阶典型抽样＜分层等比例抽样＜二阶PPS抽样。总体而言，分层二阶典型抽样的准确度相对较高，相对误差最小，仅为0.0412。故在实际应用当中。分层二阶典型抽样最为适用。

关键词：肉牛存栏量分层抽样二阶抽样典型抽样

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稳定表达流感病毒PR8株NS1蛋白MDCK细胞系的建立

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中国动物传染病学报 2011年第2期19卷 8-12页

作者：张旭滕巧泱闫丽萍周洁文徐大伟颜丕熙姬希文戴晓光王洪斌高利李泽君中国农业科学院上海兽医研究所农业部寄生虫重点开放实验室上海200241 东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030

根据流感病毒A/Puerto Rico/8/34株NS1基因的核苷酸序列设计引物,PCR扩增后,将NS1完整开放阅读框分别克隆于pMX载体和PET30a载体,成功构建了pMX-PR8-NS1和PET-PR8-NS1重组质粒。将PET-PR8-NS1重组质粒转化Jm109感受态大肠杆菌,诱导表达... 详细信息

根据流感病毒A/Puerto Rico/8/34株NS1基因的核苷酸序列设计引物,PCR扩增后,将NS1完整开放阅读框分别克隆于pMX载体和PET30a载体,成功构建了pMX-PR8-NS1和PET-PR8-NS1重组质粒。将PET-PR8-NS1重组质粒转化Jm109感受态大肠杆菌,诱导表达获得重组NS1蛋白免疫小鼠制备多抗血清。同时,将逆转录病毒载体系统pMX-PR8-NS1、pCI-NF-KB、PMDSV和MDSV共转染293T细胞,制备逆转录病毒样粒子。将逆转录病毒样粒子感染MDCK细胞,利用嘌呤霉素进行抗性筛选。然后经过PCR、RT-PCR、间接免疫荧光鉴定,获得稳定表达PR8病毒NS1蛋白的细胞系,将之命名为MDCK-PR8-NS1细胞系。该细胞系的建立有望为深入开展流感病毒NS蛋白生物学功能的研究以及为扩增NS1基因删除的流感病毒提供了有利的工具。

关键词：流感病毒 NS1基因 MDCK

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西尼罗病毒NSl蛋白特异性单克隆抗体的制备与鉴定

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中国免疫学杂志 2011年第6期27卷 529-532页

作者：马健男杨涛徐青元孙恩成林燕刘霓红杨银辉李文京步志高吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨150001 军事医学科学院微生物流行病研究所、病原微生物生物炎全国家重点实验室北京100071 中国动物疫病预防控制中心北京100125

目的：制备针对西尼罗病毒NSl蛋白的特异性单克隆抗体。方法：以原核表达的重组NSI蛋白为免疫原，免疫BALB／c小鼠并通过常规杂交瘤技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2／O细胞进行融合。以真核表达的重组NSl蛋白为检测用抗原，建立间接ELISA... 详细信息

目的：制备针对西尼罗病毒NSl蛋白的特异性单克隆抗体。方法：以原核表达的重组NSI蛋白为免疫原，免疫BALB／c小鼠并通过常规杂交瘤技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2／O细胞进行融合。以真核表达的重组NSl蛋白为检测用抗原，建立间接ELISA检测方法筛选分泌NSl蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。并利用Western blot和IFA试验对所获得的单克隆抗体进行鉴定。结果：共获得了2株稳定分泌NSl蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为WN-1CIO和WN-3D10，其亚类鉴定分别属于IgG2z和IgG1o这2株单克隆抗体均能与西尼罗病毒NSl蛋白和病毒抗原发生特异性反应，而与日本脑炎病毒无交叉反应。结论：本实验成功制备出针对西尼罗病毒NSI蛋白的特异性单克隆抗体，为我国建立西尼罗病毒与日本脑炎病毒的血清学鉴别诊断方法奠定了基础。

关键词：西尼罗病毒 NSl蛋白单克隆抗体

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表达H3N2亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒对小鼠免疫原性的研究

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中国农业科学 2010年第6期43卷 1235-1241页

作者：展小过乔传玲杨焕良陈艳孔维辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室

【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因... 详细信息

【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP。将重组病毒rAd-H3HA-EGFP以108TCID50两次接种6周龄的Balb/c小鼠,时间间隔为3周,通过检测免疫小鼠的抗体水平及对病毒攻击的保护情况评价该重组病毒的免疫原性。【结果】HA基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物性活性。重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.58×***-1,以108TCID50的剂量免疫小鼠后,能够诱导产生高水平的特异性抗体,并对H3亚型SIV的攻击提供有效保护。【结论】构建了一株具有良好免疫原性的复制缺陷型重组腺病毒,为H3亚型SI活载体疫苗的研制奠定了基础。

关键词：猪流感病毒 HA基因重组腺病毒小鼠免疫原性

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中国H5N1亚型高致病性禽流感病毒抗原变异株的鉴定分析

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畜牧兽医学报 2010年第3期41卷 305-309页

作者：李雁冰施建忠赵海丹田国彬王冬宋家升杨德全邓国华王秀荣陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家兽医生物技术重点开放实验室/国家禽流感参考实验室/农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001

对引起中国2006年山西、宁夏2省(区)H5N1亚型禽流感疫情的代表毒株——A/chicken/Shanxi/2/2006(H5N1)(CK/SX/06)进行了全面研究。结果表明该病毒具有高致病性禽流感病毒(HPAIV)特征,基因组序列分析发现其8个基因片段与中国传统H5N1亚... 详细信息

对引起中国2006年山西、宁夏2省(区)H5N1亚型禽流感疫情的代表毒株——A/chicken/Shanxi/2/2006(H5N1)(CK/SX/06)进行了全面研究。结果表明该病毒具有高致病性禽流感病毒(HPAIV)特征,基因组序列分析发现其8个基因片段与中国传统H5N1亚型禽流感病毒GS/GD/1/96(H5N1)存在较大差异,属于新的基因型——山西鸡型;抗原性分析结果表明其在抗原性方面与GS/GD/1/96同样存在较大变异,将其命名为"山西鸡型"抗原变异株;以106EID50.0.1 mL-1剂量将该病毒经鼻腔接种4周龄SPF鸭以评价其对水禽的感染能力,结果表明其不感染鸭;常规方法接种BALB/c小鼠以评价其对哺乳动物的感染和致病能力,结果表明其能感染小鼠,但不引起死亡,呈低致病力。说明该类型高致病性H5N1 HPAIV目前仅危害鸡,不具备感染水禽的能力,感染哺乳动物但不致死。该类型病毒的出现与流行为中国禽流感的免疫与防制提出新的课题。

关键词： H5N1 HPAIV CK/SX/2/06 山西鸡型抗原变异

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H9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2010年第4期40卷 384-389页

作者：包红梅王秀荣陶启蒙蔡东东王馥梅赵玉辉陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

通过分析流感数据库中123个HA序列,根据HA保守区序列设计并合成了1对引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,预期扩增片段大小为732 bp。通过对H9亚型禽流感病毒（AIV）不同稀释度的尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量... 详细信息

通过分析流感数据库中123个HA序列,根据HA保守区序列设计并合成了1对引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,预期扩增片段大小为732 bp。通过对H9亚型禽流感病毒（AIV）不同稀释度的尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×10^4.7EID50/mL;阳性棉拭子的最低检出量为1×10^2.5EID50/mL。用该方法检测H1-H15亚型AIV和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,结果仅有H9亚型AIV出现特异性目的条带,而其他均未出现目的条带。脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品在1∶10稀释度下,病毒分离和RT-PCR方法可以达到相同的阳性检出率。表明建立的AIV H9亚型RT-PCR方法具有较好的特异性和敏感性。

关键词：禽流感病毒一步法RT-PCR H9亚型

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H5亚型禽流感病毒A/Duck/Anhui/1/2006(Clade 2.3)密码子优化HA基因DNA疫苗的免疫保护效力研究

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中国预防兽医学报 2010年第2期32卷 116-120页

作者：王国俊熊杰李俊平曾显营田国彬李雁冰施建忠姜永萍陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为了进一步评价基于HA基因的DNA疫苗的开发应用前景,本研究将表达H5亚型禽流感水禽群代表株A/Duck/Anhui/1/2006(H5N1)[DKAH/1/06(H5N1)]HA基因的DNA疫苗pCAGGoAHHA的免疫保护效力进行了评估,以5μg、10μg、20μg、50μg和100μg剂量免... 详细信息

为了进一步评价基于HA基因的DNA疫苗的开发应用前景,本研究将表达H5亚型禽流感水禽群代表株A/Duck/Anhui/1/2006(H5N1)[DKAH/1/06(H5N1)]HA基因的DNA疫苗pCAGGoAHHA的免疫保护效力进行了评估,以5μg、10μg、20μg、50μg和100μg剂量免疫3周龄SPF鸡,首次免疫后3周再加强免疫一次,加强免疫后2周用106EID50的高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Duck/Fujian/31/2007(H5N1)[DKFJ/31/07(H5N1)]鼻腔途径进行攻毒,观察发病与死亡情况。分别于攻毒后第3d、5d、7d天采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测攻毒鸡排毒情况,同时检测免疫及攻毒后血清HI抗体、NT抗体的动态变化。结果,20μg、50μg、100μg组的pCAGGoAHHA均可对免疫鸡产生100%完全保护(不发病、不致死、不排毒),而5μg和10μg剂量组则可对免疫鸡分别形成25%和75%的保护。结果表明,H5亚型禽流感水禽群DNA疫苗质粒pCAGGoAHHA具有良好的免疫保护性,有望成为预防H5亚型HPAIV的技术储备候选疫苗。

关键词：禽流感 H5亚型水禽群 DNA疫苗保护效力

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H9N2亚型禽流感流行株灭活疫苗种毒的筛选

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中国预防兽医学报 2010年第4期32卷 276-280页

作者：万晓朋曾显营田国彬李雁冰邓国华施建忠刘丽玲钟功勋姜永萍王彦妮陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为筛选出具有良好免疫原性的禽流感病毒(AIV)H9N2亚型灭活流行株种毒,选择2008年中国大陆8个省份15株H9N2亚型AIV分离株进行抗原性分析,选取代表流行株进行鉴定并制备灭活疫苗,进行免疫效力评估。实验结果显示,2008年分离株之间抗原性... 详细信息

为筛选出具有良好免疫原性的禽流感病毒(AIV)H9N2亚型灭活流行株种毒,选择2008年中国大陆8个省份15株H9N2亚型AIV分离株进行抗原性分析,选取代表流行株进行鉴定并制备灭活疫苗,进行免疫效力评估。实验结果显示,2008年分离株之间抗原性比较接近,与2000年前分离株的抗原性相差较大;2008年分离的8株病毒HA基因核苷酸同源率在93.2%～98.6%之间,而CK/SH/10/01毒株与这8株病毒的同源率仅在91.9%～93.5%之间;CK/ZJ/17/08、CK/SD/2CZ/08、DK/FJ/560/08、CK/FJ/521/08、CK/HuN/174/08和CK/HuN/33/08候选株病毒在SPF鸡胚上连续传15代HA价及致病性等均未改变,SPF鸡鼻腔感染106EID50各毒株后均无任何症状和死亡出现;候选株灭活疫苗免疫SPF鸡3周时,产生针对疫苗株抗原检测的HI抗体介于10.35log2～11.811log2,以106EID50剂量鼻腔感染途径攻毒后,只有CK/HuN/174/08和CK/HuN/33/08株灭活疫苗免疫鸡不仅可以对同源毒株的攻击提供良好的免疫保护,而且对2008年分离的异源毒株的攻击也能提供比较理想的免疫保护,可作为适合我国大部分地区应用的H9N2亚型禽流感灭活疫苗种毒株。

关键词：禽流感 H9N2亚型灭活疫苗种毒筛选

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具有HI活性的H1亚型流感病毒特异性单克隆抗体的制备与应用

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中国预防兽医学报 2010年第4期32卷 307-311页

作者：李印邓国华王桂芹杨焕良乔传玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为了制备具有HI活性的HI亚型流感病毒特异性单克隆抗体(MAb),本研究以H1N1亚型猪流感病毒(SIV)株A/Swine/Guangdong/718/01(H1N1)为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经常规细胞融合后,血凝抑制(HI)方法进行检测,融合细胞经稀释克隆纯化后,获得11... 详细信息

为了制备具有HI活性的HI亚型流感病毒特异性单克隆抗体(MAb),本研究以H1N1亚型猪流感病毒(SIV)株A/Swine/Guangdong/718/01(H1N1)为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经常规细胞融合后,血凝抑制(HI)方法进行检测,融合细胞经稀释克隆纯化后,获得11株能稳定分泌抗血凝素特异性HI MAb的杂交瘤细胞株。鉴定表明,所获MAb与其他具有血凝活性的病毒以及其他14个HA亚型的流感病毒均不具有HI交叉反应,表明这11株MAb均具有良好的流感病毒亚型特异性。其中A6F、2BBF和2BB与其他H1亚型流感病毒分离株的HI试验证实我国不同地区分离株之间的抗原性存在一定差异。11株MAb对H1SIV抗原的HI试验结果显示其HI效价有明显差异。叠加实验表明这些MAb分别识别HA抗原的不同表位。间接免疫荧光试验表明,2BBF、8HB、1DH、7FC和2BB均可与2009年流行H1N1病毒A/California/04/2009HA抗原发生特异性反应。这些MAb特异性的研制为H1亚型流感病毒的疫情病原学快速诊断以及病毒抗原性变异的相关研究提供了物质基础。

关键词： H1亚型猪流感血凝抑制单克隆抗体间接免疫荧光

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Clade 2.2 H5N1亚型禽流感重组灭活疫苗株的构建及其对小鼠免疫效力的评价

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中国预防兽医学报 2010年第9期32卷 699-702页

作者：裴磊王国俊熊杰李雁冰姜永萍陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为研制安全、有效的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)重组灭活疫苗,本研究以A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)AIV为内部基因供体,以Clade2.2H5N1亚型AIV A/Bar-headed goose/Qinghai/3/2005(BHGQH/05)为表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因供体,通过反向遗传操作,在符合人类疫苗生产标准的Vero细胞中救获低致病性的疫苗毒株,将制备的灭活全病毒疫苗单次和加强免疫BALB/c小鼠,检测疫苗的免疫保护效果。实验结果表明,单次和加强免疫组小鼠均能对同源和异源病毒的攻击提供100%完全保护;加强免疫能够显著提高HI和NT抗体的水平,用BHGQH/05做抗原检测加强免疫不加佐剂组的HI和NT抗体滴度分别高达1173.3和1280。本研究为下一步在灵长类动物模型上的免疫评价以及进一步的临床试验奠定了坚实的基础。

关键词： H5N1禽流感反向遗传操作 Vero细胞系 BALB/c小鼠免疫评价

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