检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2008年第12期30卷 954-958页

作者：陶启蒙王秀荣武嘉男石霖李雁冰包红梅陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物国家重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

本研究结合非对称RT-PCR和基因芯片两种技术,构建可同时区分AIV的H5、H7、H9血凝素亚型和N1、N2神经氨酸酶亚型以及鸡传染性支气管炎病、新城疫病、鸡传染性法氏囊病的基因芯片。分别T/A克隆部分禽流感病毒的M基因,H5、H7、H9亚型HA基因... 详细信息

本研究结合非对称RT-PCR和基因芯片两种技术,构建可同时区分AIV的H5、H7、H9血凝素亚型和N1、N2神经氨酸酶亚型以及鸡传染性支气管炎病、新城疫病、鸡传染性法氏囊病的基因芯片。分别T/A克隆部分禽流感病毒的M基因,H5、H7、H9亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因,鸡传染性支气管炎病毒np基因、新城疫病np基因、鸡传染性法氏囊A基因,并构建重组质粒;以重组质粒为模板,用PCR方法扩增制备探针,纯化后点于氨基修饰的载玻片上,制备基因芯片;常规方法从待检样品中提取RNA,用Cy3标记引物进行RT-PCR,将荧光素引入PCR产物中;并对扩增条件进行优化。研究发现检测探针可特异性的与相应的标记样品进行杂交,呈现较强的杂交信号;该方法可以准确进行4种主要禽病的鉴别诊断和禽流感主要流行亚型鉴定,对感染样品和现地样品检测结果与RT-PCR、鸡胚接种有较高一致性,符合率分别为100%和96%。结果显示该方法可用于同步鉴别禽流感、鸡传染性支气管炎、新城疫、鸡传染性法氏囊病,以及现地主要流行的禽流感亚型,是一种有效的新方法。

关键词：不对称PCR 基因芯片禽病禽流感亚型鉴别

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H3N2亚型猪流感病毒重组HA1蛋白间接ELISA诊断方法的建立

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畜牧兽医学报 2008年第9期39卷 1230-1234页

作者：丁选亚乔传玲陈艳杨焕良辛晓光韩庆功陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001

以pMD18-HA质粒为模板,PCR扩增HA1基因片段并与pET30a连接后,转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达HA1蛋白,对表达蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting检测。结果表明,表达的重组HA1蛋白具有良好的反应原性,分子量约为45 ku。表达产物经过... 详细信息

以pMD18-HA质粒为模板,PCR扩增HA1基因片段并与pET30a连接后,转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达HA1蛋白,对表达蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting检测。结果表明,表达的重组HA1蛋白具有良好的反应原性,分子量约为45 ku。表达产物经过纯化作为包被抗原建立了检测H3亚型猪流感抗体的间接ELISA方法。该方法具有较高的特异性和敏感性,重复性良好,通过检测40份血清,与HI检测结果相比较,其符合率达86.5%。该方法为检测H3亚型猪流感抗体提供了一种快速、准确、简便的技术手段。

关键词：猪流感病毒 HA1蛋白间接ELISA

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H5N1亚型高致病性禽流感病毒NP基因在昆虫细胞中的表达及其表达产物的生物学活性

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中国兽医科学 2008年第5期38卷 380-385页

作者：万春和刘明刘春国杨涛刘大飞齐金龙陈浩杜金铃李洪涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

根据GenBank上登录的H5N1亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)核蛋白(NP)基因序列设计引物,通过PCR扩增出A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)毒株的NP基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,将筛选的阳性重组转座载体pFastBacGP67B-NP转化... 详细信息

根据GenBank上登录的H5N1亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)核蛋白(NP)基因序列设计引物,通过PCR扩增出A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)毒株的NP基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,将筛选的阳性重组转座载体pFastBacGP67B-NP转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,构建了杆状病毒表达载体,获得了重组转座子(rBacmid-NP),在脂质体介导下转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBv-NP)。SDS-PAGE分析、Western-blotting检测、免疫组化分析和ELISA试验结果表明,分子质量约为54 ku的重组核蛋白得到了高效表达,该表达蛋白具有良好的生物学活性。

关键词：禽流感病毒核蛋白基因昆虫细胞杆状病毒表达

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H1N1亚型猪流感病毒广东分离株全基因克隆及其遗传演化分析

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病毒学报 2008年第5期24卷 358-363页

作者：刘大飞刘明刘春国杨涛刘大程中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 莱阳市城厢兽医站山东莱阳265200

为了研究H1N1亚型SIV遗传演化与变异的特性,采用RT-PCR技术分别扩增A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)的8个基因片段,分别将其克隆到pMD18-T载体,进行全基因组序列测定。核苷酸序列测定结果显示:LM株SIV各基因片段均未发现核苷酸插入或... 详细信息

为了研究H1N1亚型SIV遗传演化与变异的特性,采用RT-PCR技术分别扩增A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)的8个基因片段,分别将其克隆到pMD18-T载体,进行全基因组序列测定。核苷酸序列测定结果显示:LM株SIV各基因片段均未发现核苷酸插入或缺失现象。HA切割位点处的氨基酸序列序列为IPSIQSR↓G,与高致病性SIV的H1N1亚型毒株的分子特征不符合。HA基因含有6个潜在的N-糖基化位点,4个在HA1的第11、23、87、和276位,增加2个分别在HA2的154和213位点;NA基因不仅在58、63、68、88和146位含有高度保守的N-糖基化位点,而且在44和235位增加2个潜在的N-糖基化位点,这可能是近期H1N1亚型SIV的一个分子特征。核苷酸同源性结果:HA基因与类人谱系的流感病毒分离株有很高的同源性(99%),而其他基因均与古典猪谱系的流感病毒分离株同源性较高(87%～98%)。从绘制的各个片段进化树和核苷酸同源性分析结果,可以推测该毒株HA基因可能来源于类人谱系的流感病毒;而其他基因来源于古典猪谱系的流感病毒。

关键词：猪流感病毒 RT-PCR 克隆遗传演化分析

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检测流感病毒H5亚型抗体竞争ELISA方法的建立及初步应用

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中国预防兽医学报 2008年第9期30卷 716-720页

作者：李雪平邓国华高玉伟唐艳玲艾嘉亮葛叶陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

本研究采用灭活的H5亚型禽流感纯化病毒包被ELISA反应板,以辣根过氧化物酶标记的HA蛋白单克隆抗体作为竞争检测抗体,建立了检测H5亚型流感病毒抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。实验结果表明:抗原最佳包被浓度为8.27μg/mL(1∶800),酶标... 详细信息

本研究采用灭活的H5亚型禽流感纯化病毒包被ELISA反应板,以辣根过氧化物酶标记的HA蛋白单克隆抗体作为竞争检测抗体,建立了检测H5亚型流感病毒抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。实验结果表明:抗原最佳包被浓度为8.27μg/mL(1∶800),酶标抗体最佳稀释倍数为1∶800,待检血清最佳稀释倍数为1∶10。对已知阳性样品的检测结果表明,本研究中所建立的竞争ELISA方法的敏感性高于经典的血凝抑制方法(HI)。特异性试验表明该ELISA方法仅能检测H5亚型流感病毒抗体,具有良好的特异性。对临床样品检测表明C-ELISA与HI方法的符合率达到93%以上。该方法可以对不同种属动物血清H5亚型流感病毒抗体进行快速定量的检测,为H5亚型流感病毒流行病学调查与抗体的检测提供了一种快速、方便、敏感的方法。

关键词：禽流感单抗竞争ELISA

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H9亚型禽流感病毒SD96株HA蛋白特异性单抗的制备及鉴定

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中国预防兽医学报 2008年第2期30卷 149-152,160页

作者：李雪平邓国华田国斌陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

本研究用H9N2亚型禽流感病毒分离株A/Chicken/Shandong/6/1996(CK/SD/6/96)免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。采用血凝抑制(HI)和ELISA方法筛选阳性细胞克隆,连续多次克隆培养后获得3株能稳定分泌H9亚... 详细信息

本研究用H9N2亚型禽流感病毒分离株A/Chicken/Shandong/6/1996(CK/SD/6/96)免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。采用血凝抑制(HI)和ELISA方法筛选阳性细胞克隆,连续多次克隆培养后获得3株能稳定分泌H9亚型HA特异性单抗的细胞株1F4C4、9F12D1、2C5H12。3株阳性杂交瘤细胞的培养上清及腹水对CK/SD/6/96的HI效价分别为26、24、21和212、210、27。特异性试验表明该3株单抗均不与其他主要禽类病毒和其他14个HA亚型的禽流感病毒发生交叉反应。1F4C4和2C5H12抗体亚类为IgG2b,9F12D1为IgG2a。这3株单抗对H9亚型不同抗原群流感毒株有不同程度的中和作用,表现出单抗识别抗原位点的差异性,为进一步研究H9亚型流感病毒的抗原性差异以及抗原识别提供了物质基础和条件。

关键词：禽流感单抗 ELISA

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H5亚型高致病性禽流感病毒抗原捕捉ELISA诊断方法的建立

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中国预防兽医学报 2008年第1期30卷 68-71,80页

作者：曲站红邓国华王桂芹张立春田国彬于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室中国兽医药品监察所北京100081

本研究在已有H5亚型禽流感病毒特异性单抗基础上,建立了以多抗作为包被抗体、单抗作为检测抗体的抗原捕捉ELISA方法。通过对各个反应条件进行优化,获得的最佳工作条件为:羊血清1∶1600倍稀释;单抗1∶10000稀释;酶标抗体最适工作浓度为1... 详细信息

本研究在已有H5亚型禽流感病毒特异性单抗基础上,建立了以多抗作为包被抗体、单抗作为检测抗体的抗原捕捉ELISA方法。通过对各个反应条件进行优化,获得的最佳工作条件为:羊血清1∶1600倍稀释;单抗1∶10000稀释;酶标抗体最适工作浓度为1∶5000倍稀释;单抗反应时间1.5h;酶标抗体作用时间1.5h。特异性试验和敏感性试验结果表明:该方法具有良好的特异性和敏感性,可用于H5亚型高致病性禽流感病毒的检测。

关键词：禽流感病毒 H5亚型 ELISA

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猪流感病毒M基因实时荧光定量PCR诊断方法的建立

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中国预防兽医学报 2008年第10期30卷 805-810页

作者：张春明乔传玲陈艳杨焕良辛晓光陈化兰冉多良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

根据猪流感病毒(SIV)M基因的保守序列,设计并合成一对特异性引物和TaqManMGB探针,建立了SIVM基因实时荧光定量PCR检测方法。使用含有M基因的重组质粒pMD-M作为标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999,检测结果表明:该方法的敏感性可达到1... 详细信息

根据猪流感病毒(SIV)M基因的保守序列,设计并合成一对特异性引物和TaqManMGB探针,建立了SIVM基因实时荧光定量PCR检测方法。使用含有M基因的重组质粒pMD-M作为标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999,检测结果表明:该方法的敏感性可达到1个EID50,组间与组内重复试验变异系数分别为0.21%和0.65%,除SIV外,其他5种猪病病毒检测均为阴性,样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均达到100%,该方法特异性强、重复性好,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法。

关键词： SIV Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR

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猪流感病毒血凝素基因原核表达及其在间接ELISA中的初步应用

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畜牧与兽医 2008年第11期40卷 10-13页

作者：陈艳乔传玲丁选亚杨焕良辛晓光韩庆功陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

利用RT-PCR方法扩增猪流感病毒A/Swine/Henan/11/2005(H1N1)血凝素(HA)基因,克隆于pMD18-T载体进行测序。以pMD18-HA为模板、利用带酶切位点的引物再次扩增HA基因的开放阅读框(ORF),克隆到表达载体pET32a中,经双酶切、测序及PCR鉴定得... 详细信息

利用RT-PCR方法扩增猪流感病毒A/Swine/Henan/11/2005(H1N1)血凝素(HA)基因,克隆于pMD18-T载体进行测序。以pMD18-HA为模板、利用带酶切位点的引物再次扩增HA基因的开放阅读框(ORF),克隆到表达载体pET32a中,经双酶切、测序及PCR鉴定得到阳性重组表达质粒pET-HA,将质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,HA蛋白获得了高效表达,经Western-blot检测证实表达产物具有良好的免疫学活性,在间接ELISA中的初步应用表明具有良好的抗原反应性。本研究为以重组HA蛋白为抗原建立H1亚型猪流感抗体的ELISA检测方法奠定了基础。

关键词：猪流感病毒 HA基因原核表达

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H5亚型禽流感病毒一步法复合RT-PCR检测方法的建立

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中国兽医学报 2008年第7期28卷 804-808页

作者：包红梅王秀荣李一经陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

针对近年来H5亚型禽流感(AI)频发的严峻形势,本研究通过分析GenBank中AI的221个HA基因和M基因序列,在保守区内用Oligo4.0软件设计合成2对引物,建立了能同时鉴别AIV型与亚型的一步法复合RT-PCR,其扩增的目的片段大小分别为372、229 bp。... 详细信息

针对近年来H5亚型禽流感(AI)频发的严峻形势,本研究通过分析GenBank中AI的221个HA基因和M基因序列,在保守区内用Oligo4.0软件设计合成2对引物,建立了能同时鉴别AIV型与亚型的一步法复合RT-PCR,其扩增的目的片段大小分别为372、229 bp。通过对AIV尿囊液和棉拭子浸出液进行不同稀释倍数检测,结果病毒在尿囊液最低检出量为10-4稀释。用病毒分离和该方法同时检测不同脏器、口咽及泄殖腔棉拭子样品,结果该方法检测灵敏度比病毒分离低10~100倍。用该方法检测H1~H15亚型AIV和鸡新城疫病毒等其他14种禽病毒,结果所有AIV均有M基因229 bp的目的条带,且仅H5亚型AIV有372 bp的特异性条带,而其他14种禽病毒无任何目的条带。

关键词：禽流感病毒一步法复合RT-PCR H5N1 亚型鉴别快速诊断

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