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黑龙江畜牧兽医 2012年第7期 113-115页

作者：王寿山张超林刘春国石薇琳刘彦云王伟刘明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感开放实验室及国家禽流感参考实验室/OIE禽流感参考实验室哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030

禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）是正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒。禽流感又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟,被国际兽医局（OIE）列为A类传染病。H9N2亚型AIV为低致病性禽流感病毒,虽然毒力较H5N1亚型AIV弱,

关键词： H9N2亚型禽流感病毒序列分析 NA基因低致病性禽流感病毒 HA A型流感病毒 H5N1亚型 virus

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表达H5亚型禽流感同义(Consensus)HA蛋白的重组质粒构建及体外表达

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中国预防兽医学报 2012年第7期34卷 510-513页

作者：常晓飞赵双成田石柳金雄王靖飞曾显营胡永浩姜永萍陈化兰甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730007 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与技术服务中心黑龙江哈尔滨150001

为研究禽流感病毒(AIV)H5亚型同义Consensus HA(Cons-HA5)基因的重组表达质粒在体外的表达情况,本研究通过对从NCBI流感数据库中获得的5000条H5亚型AIV的HA蛋白的序列比对、分析获得一条同义HA蛋白,将其相对应的核苷酸序列进行鸡体偏嗜... 详细信息

为研究禽流感病毒(AIV)H5亚型同义Consensus HA(Cons-HA5)基因的重组表达质粒在体外的表达情况,本研究通过对从NCBI流感数据库中获得的5000条H5亚型AIV的HA蛋白的序列比对、分析获得一条同义HA蛋白,将其相对应的核苷酸序列进行鸡体偏嗜性密码子优化,人工合成Cons-HA5基因并克隆于真核表达载体pCAGGS中构建重组表达质粒pCACons-HA5。将重组质粒转染293-T细胞,在激光共聚焦显微镜下观察转染后不同时间HA蛋白的表达情况,同时在转染后24 h、48 h后分别进行表达蛋白的western blot检测。结果表明,pCACons-HA5转染293-T细胞后,其表达的HA蛋白先分布于细胞质中,而后转移至细胞膜表面;westernblot鉴定结果表明,Cons-HA5重组蛋白可以与AIV多克隆血清反应分子量约为70 ku。该重组质粒的构建将为进一步Cons-HA5核酸免疫对H5亚型不同抗原群AIV的交叉保护免疫效力研究奠定基础。

关键词： H5亚型禽流感病毒同义HA基因表达

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gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

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中国预防兽医学报 2012年第11期34卷 847-853页

作者：欧阳伟朱向东王永山王永强潘群兴毕振威王笑梅江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究microRNA(gga-miR-21)对传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制的影响,本研究利用PCR方法从鸡的肝细胞基因组中扩增细胞pri-gga-miR-21,克隆于慢病毒表达质粒pL-EGFP中构建重组质粒pL-miR-21。将pL-miR-21与3个包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293FT细胞,制备含gga-miR-21基因的重组慢病毒VL+miR-21。将VL+miR-21感染DF-1细胞,经杀稻瘟菌素筛选获得过表达gga-miR-21的细胞株DF-miR-21,采用定量RT-PCR(qRT-PCR)检测表明,gga-miR-21的表达量比正常DF-1细胞提高60%。将IBDV接种于DF-miR-21细胞,在96 h后,其病毒滴度(104.75TCID50/0.1 mL)显著低于正常DF-1细胞的病毒滴度(108.75TCID50/0.1 mL)。采用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析验证,在IBDV基因组VP1基因中存在gga-miR-21的结合靶点。将IBDV感染DF-miR-21细胞,采用western blot分析,VP1蛋白的表达量比正常DF-1细胞显著降低;用qRT-PCR分析,VP1 mRNA水平与正常DF-1细胞没有明显差异。本实验结果表明:细胞gga-miR-21可以抑制IBDV的复制,其分子作用机理是在VP1基因翻译水平上实现的。

关键词：传染性法氏囊病病毒 miRNA gga-miR-21 慢病毒表达系统病毒复制

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传染性法氏囊病病毒感染细胞内源性microRNA表达差异分析

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中国兽医学报 2012年第3期32卷 329-336页

作者：欧阳伟王永山王永强王笑梅朱向东毕振威范红结江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

细胞内源性microRNA(miRNA)在宿主与病原相互作用过程中发挥着重要的调节功能。为了分析细胞内源性miRNA与传染性法氏囊病病毒(IBDV)的相互作用,用IBDV弱毒和强毒分别感染鸡胚成纤维细胞(CEF)和SPF鸡,24h后,取感染CEF和法氏囊组织,提取... 详细信息

细胞内源性microRNA(miRNA)在宿主与病原相互作用过程中发挥着重要的调节功能。为了分析细胞内源性miRNA与传染性法氏囊病病毒(IBDV)的相互作用,用IBDV弱毒和强毒分别感染鸡胚成纤维细胞(CEF)和SPF鸡,24h后,取感染CEF和法氏囊组织,提取细胞总RNA,用Hy3/Hy5双色荧光标记,与miRNA芯片杂交,进行芯片内标准化、芯片间标准化、表达差异比较以及聚类分析。结果显示:在IBDV弱毒感染的CEF中,有17个细胞内源性miRNA表达上调,17个miRNA表达下调;在IBDV强毒感染的鸡法氏囊组织细胞中,有30个细胞内源性miRNA表达上调,18个miRNA表达下调。根据表达差异显著的miRNA序列设计引物,用荧光定量RT-PCR方法验证芯片检测结果,2种方法的检测结果一致。结果表明,IBDV感染可诱导细胞内源性miRNA表达变化,这些上调或下调的miRNA能调控细胞内多种代谢和信号传导途径发生异常,引起细胞及组织器官发生病理学变化。

关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV) microRNA(miRNA) 基因芯片荧光定量PCR

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表达犬瘟热病毒H基因重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究

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中国预防兽医学报 2012年第4期34卷 257-261页

作者：田美杰葛金英王喜军冯娜马良帅磊苏华高玉伟夏咸柱步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为研制安全、有效的新型犬瘟热疫苗,本研究利用新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,构建出表达犬瘟热病毒(CDV)弱毒疫苗株Rockborn-20/8血凝素(H)蛋白的重组病毒rLa-CDV-H,并对其生物学特性进行鉴定,评估其作为犬瘟热活... 详细信息

为研制安全、有效的新型犬瘟热疫苗,本研究利用新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,构建出表达犬瘟热病毒(CDV)弱毒疫苗株Rockborn-20/8血凝素(H)蛋白的重组病毒rLa-CDV-H,并对其生物学特性进行鉴定,评估其作为犬瘟热活载体疫苗的安全性和有效性。通过免疫荧光和western blot试验证明了CDV H蛋白的正确表达;重组病毒株保持了LaSota亲本株的低致病性和高滴度鸡胚生长特性;重组病毒rLa-CDV-H接种12周龄比格犬后,可以诱导显著的CDV中和抗体反应。本研究表明重组病毒rLa-CDV-H具有作为犬瘟热重组病毒活载体疫苗的潜力。

关键词：犬瘟热病毒血凝素蛋白重组新城疫病毒

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抗蓝舌病病毒VP6和VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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中国预防兽医学报 2012年第5期34卷 412-414页

作者：魏鹏孙恩成刘霓红杨涛徐青元秦永丽赵晶冯瑜菲王文世张翠云吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 湖南农业大学动物医学学院湖南长沙410128

为制备针对蓝舌病病毒(BTV)的单克隆抗体(MAb),本研究利用血清型1型BTV(BTV1)免疫BALB/c鼠,将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,并用BTV1包被ELISA板,通过间接ELISA方法筛选出3株稳定分泌抗BTV1的MAb的杂交瘤细胞株(2B10、3D4和4H8)。利用表... 详细信息

为制备针对蓝舌病病毒(BTV)的单克隆抗体(MAb),本研究利用血清型1型BTV(BTV1)免疫BALB/c鼠,将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,并用BTV1包被ELISA板,通过间接ELISA方法筛选出3株稳定分泌抗BTV1的MAb的杂交瘤细胞株(2B10、3D4和4H8)。利用表达BTV1主要蛋白的真核表达重组质粒转染BHK-21后,对所制备的杂交瘤细胞株上清进行间接免疫荧光(IFA)以及western blot鉴定,结果显示:2B10和4H8与VP7蛋白反应,而3D4与VP6蛋白反应。同时,IFA鉴定结果进一步表明,3株MAb与24个血清型的BTV均可以发生反应。本研究制备的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词：蓝舌病病毒单克隆抗体 VP6蛋白 VP7蛋白

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H5亚型禽流感病毒样颗粒的构建及生物学活性鉴定

H5亚型禽流感病毒样颗粒的构建及生物学活性鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会

作者：张超林刘春国王寿山石薇琳李建辉王伟刘彦云刘明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点实验室

为研究禽流感病毒(AIV)结构蛋白在昆虫细胞中的表达及其生物活性,本研究通过杆状病毒/昆虫细胞表达系统,单独表达H5亚型AIV血凝素(HA)及共表达HA和基质蛋白(M1),并采用免疫组织化学法,SDS-PAGE,westem blot和血凝实验等对重组蛋白进行... 详细信息

为研究禽流感病毒(AIV)结构蛋白在昆虫细胞中的表达及其生物活性,本研究通过杆状病毒/昆虫细胞表达系统,单独表达H5亚型AIV血凝素(HA)及共表达HA和基质蛋白(M1),并采用免疫组织化学法,SDS-PAGE,westem blot和血凝实验等对重组蛋白进行鉴定及分析。实验结果表明:透射电子显微镜观察结果显示,共表达HA和M1的重组蛋白可以形成病毒样颗粒(VLPs),而单独表达HA未观察到VLPs;表达的重组蛋白HA和HA-M1都能够凝集鸡红细胞,血凝效价分别为1:27和1:28。结果显示该方法获得的AIV结构蛋白,具有良好的生物学活性和抗原活性,从而为禽流感VLPs疫苗的研究提供依据。

关键词：流感病毒血凝素基因基质蛋白基因杆状病毒表达系统

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蓝舌病病毒重组VP7蛋白单克隆抗体制备及竞争ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2012年第5期34卷 388-392页

作者：耿宏伟秦永丽李俊平杨涛孙恩成刘霓红白安斌徐青元王凌凤赵晶覃绍敏林俊郭怡璠吴东来东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江省农业科学院黑龙江哈尔滨150086 广西兽医研究所广西南宁530001 广西大学广西南宁530004

为了建立蓝舌病(BT)的血清学诊断方法,本研究利用原核表达的蓝舌病病毒(BTV)血清型12型VP7纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备2株单克隆抗体(MAb),分别命名为BTV-2D10和BTV-4H7。IFA试验表明,2株MAb均能与BTV 24个血清型发生特异性反应,而与... 详细信息

为了建立蓝舌病(BT)的血清学诊断方法,本研究利用原核表达的蓝舌病病毒(BTV)血清型12型VP7纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备2株单克隆抗体(MAb),分别命名为BTV-2D10和BTV-4H7。IFA试验表明,2株MAb均能与BTV 24个血清型发生特异性反应,而与茨城病病毒(IBAV)、中山病病毒(CV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛肠道病毒(BEV)、牛呼肠孤病毒(RV)及口蹄疫病毒(FMDV)无交叉反应,表明2株MAb均为BTV群特异性抗体。采用重组表达的VP7蛋白作为包被抗原建立的竞争ELISA方法证明,BTV-4H7 MAb对不同血清型BTV阳性血清具有良好的阻断效果,而对AKAV、IBAV、BRV和FMDV阳性血清无阻断作用。本研究建立的竞争ELISA方法与IDEXX公司的试剂盒检测包括65份已知背景血清和322份采自广西省的山羊血清样品,检测结果符合率分别达100%和98%。该竞争ELISA方法的建立为BTV抗体的监测提供了安全、快速、准确的技术手段。

关键词：蓝舌病病毒重组VP7蛋白群特异性单克隆抗体竞争ELISA

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2009年～2011年中国南方H4亚型禽流感病毒生物学特性研究

2009年～2011年中国南方H4亚型禽流感病毒生物学特性研究

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中国畜牧兽医学会禽病学分会第十六次学术研讨会

作者：张文亮张曦朱占松谭丹崔鹏飞施建忠邓国华陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室

我国南方地区一直以来是禽流感的易发地,目前该区域已分离到的禽流感病毒除高致病性禽流感(HPAIV)外,也存在多种低致病性禽流感(IPAIV)并存现象,尤其是近年来H6和H9等LPAIV呈现广泛流行态势。2009年以来,在中国南方地区的正常禽流感疫... 详细信息

我国南方地区一直以来是禽流感的易发地,目前该区域已分离到的禽流感病毒除高致病性禽流感(HPAIV)外,也存在多种低致病性禽流感(IPAIV)并存现象,尤其是近年来H6和H9等LPAIV呈现广泛流行态势。2009年以来,在中国南方地区的正常禽流感疫情监测过程中分离到多株H4亚型禽流感病毒(AIV),发现H4亚型禽流感病毒的分离率逐渐提高。本研究对2009年至2011年间分离的55株病毒进行RNA提取、基因组扩增、序列分析、相关抗原性分析以及对小鼠的感染能力评估,以了解我国当前南方地区H4亚型AIV的遗传进化关系,抗原

关键词：禽流感病毒生物学特性研究中国南方

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蓝舌病病毒VP5蛋白的原核表达及其抗原性分析

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中国预防兽医学报 2012年第8期34卷 607-610页

作者：赵大维朱彦青陈伟业胡倩倩殷倩倩黄克和步志高南京农业大学动物医学学院江苏南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 南京农业大学公共管理学院江苏南京210095

为表达蓝舌病病毒(BTV)VP5蛋白并检测其生物学活性,本实验采用RT-PCR方法扩增血清12型BTV的VP5基因,构建重组质粒pMAL-VP5。将重组质粒转化TB1感受态细胞,以0.4 mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,融合了大肠杆菌麦芽糖结... 详细信息

为表达蓝舌病病毒(BTV)VP5蛋白并检测其生物学活性,本实验采用RT-PCR方法扩增血清12型BTV的VP5基因,构建重组质粒pMAL-VP5。将重组质粒转化TB1感受态细胞,以0.4 mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,融合了大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的VP5重组蛋白以可溶形式表达,分子质量约为112.2 ku。利用MBP标签对重组蛋白进行纯化,并以其作为包被抗原,间接ELISA检测山羊血清样品,结果 5份羊血清P/N值均大于1,其中有1只羊检测结果 P/N值为2.396,鉴定为阳性血清,表明重组蛋白可以与VP5抗体反应,可以作为检测BTV VP5抗体的抗原,为今后进一步开展BT诊断研究奠定了基础。

关键词：蓝舌病病毒 VP5基因原核表达间接ELISA

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