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中国畜牧兽医学会禽病分会第十三次学术研讨会

作者：姜永萍张洪波张平静左青山夏俊陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨黑龙江150001

本研究将H5亚型禽流感DNA疫苗pCAGGoptiHA5对SPF鸡的最小免疫剂量进行了测定.分别以50μg、10μg、5μg和1μg不同剂量pCAGGoptiHA5一次免疫,50μg和10μg剂量一次免疫可对免疫鸡形成100％的保护(不发病、不致死),5μg和1μg pCAGGopti... 详细信息

本研究将H5亚型禽流感DNA疫苗pCAGGoptiHA5对SPF鸡的最小免疫剂量进行了测定.分别以50μg、10μg、5μg和1μg不同剂量pCAGGoptiHA5一次免疫,50μg和10μg剂量一次免疫可对免疫鸡形成100％的保护(不发病、不致死),5μg和1μg pCAGGoptiHA5一次免疫可对免疫鸡形成62.5％(5/8)和87.5(7/8)的死亡保护;分别以50μg、10μg、5μg和1μg不同剂量pCAGGoptiHA5两次免疫后,50μg和10μg剂量两次免疫后可对免疫鸡形成100％完全保护(不发病、不致死、不排毒),5μg和1μg pCAGGoptiHA5两次免疫可对免疫鸡形成100％的保护(不发病、不致死).结果表明,DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5能使免疫鸡获得保护的最小免疫剂量为1μg,具有很高的开发应用前景.

关键词：禽流感 H5亚型 DNA疫苗最小免疫剂量

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重组核蛋白检测鸭血清禽流感抗体间接ELISA方法的建立

重组核蛋白检测鸭血清禽流感抗体间接ELISA方法的建立

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中国畜牧兽医学会禽病分会第十三次学术研讨会

作者：邓国华曲站红熊蕊黎玉梅田国彬陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

本实验利用禽流感重组核蛋白作为包被抗原,建立了检测鸭血清禽流感抗体的间接ELISA方法,通过对各个工作组份反应条件的优化,确定的最佳工作条件为:包被抗原1∶300稀释(蛋白含量为8μg/mL);待检血清1∶200稀释;酶标抗体1∶7000稀释;封闭... 详细信息

本实验利用禽流感重组核蛋白作为包被抗原,建立了检测鸭血清禽流感抗体的间接ELISA方法,通过对各个工作组份反应条件的优化,确定的最佳工作条件为:包被抗原1∶300稀释(蛋白含量为8μg/mL);待检血清1∶200稀释;酶标抗体1∶7000稀释;封闭时间、待检血清和酶标二抗最佳作用时间均为1.5h.通过对907份鸭血清样本(包括141份免疫血清和766份现地血清)进行检测,经符合实验(AGP和HI)验证,同接ELISA方法与AGP的符合率为74.4％,与HI的符合率为95.0％,说明该检测方法具有很高的灵敏性和特异性.

关键词：禽流感重组核蛋白间接ELISA 抗体检测鸭血清

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禽流感快速诊断方法

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畜牧兽医科技信息 2006年第7期22卷 6-7页

作者：郝婧邓国华郝永清内蒙古农业大学动物科学与医学学院呼和浩特010018 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

禽流行性感冒(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒引起的禽类的一种急性高度接触性传染病,国际动物卫生组织将其列为A类动物传染病,我国将其列为一类疫病。该病1878年首次发生于意大利,当时称之为“鸡瘟”,现已几乎遍布世界各地。AI可... 详细信息

禽流行性感冒(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒引起的禽类的一种急性高度接触性传染病,国际动物卫生组织将其列为A类动物传染病,我国将其列为一类疫病。该病1878年首次发生于意大利,当时称之为“鸡瘟”,现已几乎遍布世界各地。AI可引起大多数家禽、野禽及水禽的感染,其中以鸡和火鸡最为易感,水禽则认为是流感病毒的自然宿主,一般情况下感染带毒而不发病。哺乳动物也可发生不同程度的感染。禽流感病毒已经席卷亚欧大陆、欧洲和非洲。在东南亚各国包括中国在内,H5N1亚型禽流感病毒已感染204人,113人死亡。禽流感病毒根据表面糖蛋白HA和NA的抗原性差异可以分为16个HA亚型和9个NA亚型,不同亚型病毒之间可以通过交换某些基因片段发生基因重排,出现具有新的生物学特征的病毒,因此,禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)最显著的生物学特征之一就是亚型众多。而且,不同亚型或血清型之间无交叉反应性或反应性低,这使得禽流感的诊断监测工作较为困难。[第一段]

关键词：禽流感病毒快速诊断方法 H5N1亚型 A型流感病毒国际动物卫生组织生物学特征禽流行性感冒接触性传染病动物传染病抗原性差异

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通过载体表达siRNAs抑制禽流感病毒复制的研究

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科技导报 2006年第3期24卷 9-13页

作者：操胜刘光亮孟庆文杨增岐亓文宝于康震吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 农业部畜牧兽医总站北京100026 西北农林科技大学动物科技学院

禽流感病毒是养禽业危害最严重的病原微生物之一。为探讨小干涉RNA(siRNA)对A型禽流感病毒复制的干扰作用,以H5亚型AIV PB2基因为靶序列,设计合成了4对编码siRNAs的DNA序列,将其克隆到psiRNA-hH1neo载体中,构建siRNAs表达载体,鉴定正确... 详细信息

禽流感病毒是养禽业危害最严重的病原微生物之一。为探讨小干涉RNA(siRNA)对A型禽流感病毒复制的干扰作用,以H5亚型AIV PB2基因为靶序列,设计合成了4对编码siRNAs的DNA序列,将其克隆到psiRNA-hH1neo载体中,构建siRNAs表达载体,鉴定正确后将重组质粒转染MDCK细胞,采用G418筛选建立抗性细胞系,用血凝(HA)试验和real time RT-PCR试验检测抑制效果, 在细胞水平筛选出具有高效抑制AIV复制的2个靶位点PB2-1154、PB2-342、为AIV的基因功能研究,抗病毒药物的开发和转基因动物的研究奠定了基础。

关键词：禽流感病毒聚合酶Ⅱ基因 RNA干扰

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胶体金试纸条检测H5亚型禽流感病毒的研究

胶体金试纸条检测H5亚型禽流感病毒的研究

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中国畜牧兽医学会禽病分会第十三次学术研讨会

作者：邓国华曲站红林涛黎玉梅熊蕊施建忠赖清金李雁冰陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 漳州格林沃生物公司

本研究用一株H5亚型特异性的流感病毒单抗标记胶体金,另一株单抗包被于硝酸纤维素膜上,建立起H5亚型特异性的胶体金层析法检测试纸条,用该试纸条可以特异性的检测出H5亚型特异性流感病毒,而其他亚型流感病毒和其他禽类病毒均不能检测到... 详细信息

本研究用一株H5亚型特异性的流感病毒单抗标记胶体金,另一株单抗包被于硝酸纤维素膜上,建立起H5亚型特异性的胶体金层析法检测试纸条,用该试纸条可以特异性的检测出H5亚型特异性流感病毒,而其他亚型流感病毒和其他禽类病毒均不能检测到.同时用HA试验进行比较,试纸条检测法的敏感性比HA试验高4倍左右,试纸条检测阳性的样品均呈现H5亚型流感病毒阳性.该试纸条可以检测临床试验感染死亡鸡的脏器匀浆液中H5亚型流感病毒的存在.

关键词：胶体金试纸条 H5亚型禽流感病毒

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H9N2亚型猪流感病毒分离株A/Swine/Shandong/1/02的基因序列分析

H9N2亚型猪流感病毒分离株A/Swine/Shandong/1/02的基因序列分析

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中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术年会

作者：杨焕良乔传玲陈艳辛晓光李海燕陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物流感中心黑龙江哈尔滨150001

02年从山东猪群中分离到1株H9N2亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Shandong/1/02(H9N2),进行了全病毒基因序列分析.结果表明,该毒株8个基因的核苷酸序列均来自禽流感病毒(AIV),与1997年分离株A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)具有很高的同源性... 详细信息

02年从山东猪群中分离到1株H9N2亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Shandong/1/02(H9N2),进行了全病毒基因序列分析.结果表明,该毒株8个基因的核苷酸序列均来自禽流感病毒(AIV),与1997年分离株A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)具有很高的同源性(94.1％-98.9％),与1994年的A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)同源性((94.5％-98.2％);推导其血凝素(HA)裂解位点处的氨基酸序列为P-A-R-S-S-R,完全符合H9亚型AIV欧亚分支中的类A/Chicken/Beijing/1/94亚分支的特征;基因分析表明,我们从猪群中分离到SWSD1/02株所有基因片断均来源于H9N2亚型禽流感病毒,病毒并未在猪体内发生重组产生特殊抗原性和新的亚型.

关键词：猪流感病毒 H9N2 基因序列分析

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表达禽流感病毒NA1及NA2基因重组禽痘病毒的构建

表达禽流感病毒NA1及NA2基因重组禽痘病毒的构建

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中国畜牧兽医学会禽病学分会第十三次学术研讨会

作者：王全英乔传玲张洪波陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室暨兽医生物技术国家重点实验室内蒙古农业大学动物医学系

从含有禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)NA1基因的质粒PMD18-TNA1中切下NA1基因片段,将其亚克隆到pSY538的EcoRI位点,将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因平端克隆到该质粒的SmaI位点,然后切下同时含有NA1及LacZ基因的片段再亚克... 详细信息

从含有禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)NA1基因的质粒PMD18-TNA1中切下NA1基因片段,将其亚克隆到pSY538的EcoRI位点,将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因平端克隆到该质粒的SmaI位点,然后切下同时含有NA1及LacZ基因的片段再亚克隆到禽痘病毒载体pSY681的NotI位点,从而构建出表达AIV NA1基因的重组禽痘病毒转移载体。应用脂质体介导的方法将转移载体转染已感染禽痘病毒S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞,在X-gal存在的条件下,经过蓝白斑筛选、数轮蚀斑纯化、PCR和Western-blot检测等,结果获得了能稳定表达NA1蛋白的重组禽痘病毒。从含有禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/21/02(H9N2)NA2基因的质粒PBD-NA2中扩增出NA2基因片段,将其克隆到PCAGG的SmaI位点,同时将pSY538用EcoRI和BamHI进行双酶切,然后用EcoRⅠ和BglⅡ将NA2基因切下,将其粘端亚克隆到pSY538的EcoRI和BamHI位点,以下同NA1的重组禽痘病毒的构建,结果获得了能稳定表达NA2蛋白的重组禽痘病毒。实验结果表明所获得的重组病毒rFPV-NA1和rFPV-NA2遗传性状稳定,并能够对其重组的单个外源基因进行表达,且在培养细胞中的表达产物具有与AIV蛋白相似的生物学特性。

关键词：禽流感病毒神经氨酸酶基因重组禽痘病毒

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一株鹅源H5N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析

一株鹅源H5N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析

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中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术年会

作者：刘春国刘明杨涛张云张晓霁潘蔚绮中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001 中国科学院广州生物医药与健康研究院广州510663

分离到一株鹅源H5N2亚型禽流感病毒,S P F鸡静脉接种致病指数为2.99,但鸭子对该病毒不敏感.病毒感染小鼠后仅在肺内复制,但不致病.HA蛋白裂解位点上插入有多个连续的碱性氨基酸(RRRKKR),从分子上证实这是一株高致病性禽流感病毒.核酸序... 详细信息

分离到一株鹅源H5N2亚型禽流感病毒,S P F鸡静脉接种致病指数为2.99,但鸭子对该病毒不敏感.病毒感染小鼠后仅在肺内复制,但不致病.HA蛋白裂解位点上插入有多个连续的碱性氨基酸(RRRKKR),从分子上证实这是一株高致病性禽流感病毒.核酸序列比较分析表明W2株流感病毒HA基因与CK/HB/489/2004(H5N1)同源率达到99.4％,NA基因与CK/JL/53/01(H9N2)同源率达到99.8％;氨基酸水平上,HA与04年分离到的CK/HB/489/200(H5N1)、CK/HN/210/200(H5N1)、WD/GD/314/20(H5N1)和Swan/GX/307/2(H5N1)四株H5N1亚型流感病毒的同源率均为99.3％,NA与CK/JL/53/01(H9N2)同源率为99.6％.HA蛋白中含有8个潜在的糖基化位点,比大多数流感病毒多出一个170位的***蛋白222位和226位分别为Gln和Gly;226位为Leu,在基因序列上保持着与近期大陆分离的H5N1亚型禽流感毒株相近的分子特征.

关键词：禽流感病毒 H5N2亚型高致病性序列分析生物学特性

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H5亚型禽流感病毒HA基因昆虫／杆状病毒系统的表达及对BALB/c小鼠的免疫保护

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科技导报 2006年第3期24卷 5-8页

作者：孟庆文刘光亮于康震童光志刘娣施建忠陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 东北林业大学博士后流动站黑龙江省农业科学院博士后工作站北京100026 农业部畜牧兽医总站哈尔滨150086

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1／96 H5N1亚型1．7kb HA基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T中并测序。亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacA的蜜蜂蜂毒素分泌信号下游中,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-BlueTM DNA)共转染... 详细信息

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1／96 H5N1亚型1．7kb HA基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T中并测序。亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacA的蜜蜂蜂毒素分泌信号下游中,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-BlueTM DNA)共转染Sf9昆虫细胞。将重组杆状病毒感染HFive细胞,72h左右收获细胞,超声波裂解,SDS—PAGE结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得表达。蛋白胶薄层扫描分析显示:表达的HA蛋白占重组杆状病毒感染细胞总蛋白含量的17．1％。Western-blot 及血凝实验结果显示,表达的禽流感H5N1亚型病毒HA蛋白具有生物学活性。表达的H5 HA蛋白定量乳化后,皮下多点注射免疫SPF 级BALB/c雌性小鼠,免疫后产生了H5 HA特异抗体,并在三免前后达到并保持较高水平。用致死剂量的HPAIV H5N1攻击小鼠,免疫组小鼠提供了100％的保护力,而对照组小鼠先后发病且死亡:为研制禽流感H5N1亚型病毒亚单位疫苗,防制禽流感奠定了基础。

关键词：禽流感病毒血凝素重组杆状病毒亚单位疫苗免疫保护

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H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96株反向基因操作系统的建立

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中国农业科学 2005年第8期38卷 1686-1690页

作者：李泽君焦培荣于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/农业部动物流感重点实验室和兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/农业部动物流感重点实验室和兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 农业部畜牧兽医总站北京100026

A/goose/Guangdong/1/96(GSGD/1/96)是中国分离的第1株H5N1亚型禽流感病毒,它不仅是97香港感染并致人死亡的H5N1亚型流感病毒HA基因供体株,而且是中国目前已报到的H5亚型流感病毒分离株的共同祖先。本研究建立了该病毒的8质粒反向基因... 详细信息

A/goose/Guangdong/1/96(GSGD/1/96)是中国分离的第1株H5N1亚型禽流感病毒,它不仅是97香港感染并致人死亡的H5N1亚型流感病毒HA基因供体株,而且是中国目前已报到的H5亚型流感病毒分离株的共同祖先。本研究建立了该病毒的8质粒反向基因操作系统,并通过细胞转染成功拯救了该病毒(R-GSGD/1/96)。R-GSGD/1/96在对SPF鸡和Balb/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野毒(W-GSGD/1/96)一致的生物学特性,即对鸡都是高致病性毒株,R-GSGD/1/96与W-GSGD/1/96的静脉致病指数分别为2.01和2.10;救获病毒与野生病毒一样,尽管106EID50经鼻腔感染小鼠后1～2d内能从肺脏检测到低滴度的病毒,但不能在小鼠体内成功复制。GSGD/1/96反向基因操作系统的成功建立为进一步开展中国高致病性禽流感病毒分离株的生物学特性、遗传衍化及结构与其功能关系研究奠定了基础。

关键词：禽流感病毒 H5N1 反向基因操作

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