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2013年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理学专业委员会学术研讨会

作者：席娜王文世冯瑜菲李俊平吴东来孙恩成孙亮魏天杨涛徐青元刘二战孙晶魏鹏中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

目的:利用真核表达系统对BTV8型VP2蛋白进行表达并对其抗原性进行检测。方法:从BTV8感染的BHK-21细胞提取病毒RNA,依据Genback中已登录的BTV8的L2基因序列设计一对引物,采用RT-PCR技术扩增BTV8 VP2全长基因,将VP2基因和pFastBacHTA供体... 详细信息

目的:利用真核表达系统对BTV8型VP2蛋白进行表达并对其抗原性进行检测。方法:从BTV8感染的BHK-21细胞提取病毒RNA,依据Genback中已登录的BTV8的L2基因序列设计一对引物,采用RT-PCR技术扩增BTV8 VP2全长基因,将VP2基因和pFastBacHTA供体质粒分别经BamHI和HindⅢ酶切后连接转化将其克隆到pFast-BacHTA供体质粒中构建重组pFast-VP2质粒,双酶切和测序鉴定后将pFast-VP2转化DH10Bac感受态细胞制备提取重组杆粒BAC-VP2,经PCR鉴定后在脂质体Cellfectin Reagent作用下将重组杆粒BAC-VP2转染Sf21细胞,转染后的Sf21细胞经蛋白质印迹检测VP2蛋白及其生物活性。结果:经双酶切以及测序鉴定成功构建了真核表达载体pFast-VP2,利用杆状病毒表达系统成功表达出BTV8重组蛋白VP2.通过包涵体纯化方法对其进行了纯化,Western blot结果显示该蛋白可以与抗BTV8绵羊阳性血清产生反应,显示出良好的抗原性。结论:昆虫杆状病毒表达载体具有高效性和灵活性,能高效地表达大片段基因也能同时表达多个基因,而且表达的重组蛋白经糖基化、磷酸化、二硫键的形成等翻译加工后在结构和功能上更接近天然蛋白,使得重组蛋白具有较好的生物活性。本研究构建的BTV8 VP2蛋白的真核表达载体,为后期建立稳定表达VP2蛋白的细胞模型和VP2蛋白功能研究奠定了基础。

关键词：动物医学蓝舌病病毒重组蛋白真核表达抗原性检测

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蓝舌病病毒VP7蛋白竞争抑制群特异性构象抗原表位的初步鉴定

蓝舌病病毒VP7蛋白竞争抑制群特异性构象抗原表位的初步鉴定

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2013年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理学专业委员会学术研讨会

作者：魏天徐青元耿宏伟冯瑜菲杨涛孙恩成席娜钱爱东吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130000

VP7蛋白作为蓝舌病病毒群特异性抗原，在BTV各个血清型中高度保守，而针对VP7蛋白的血清学检测方法也是当前检测BT的主要方法之一。本研究通过鉴定BTV VP7蛋白竞争抑制群特异性构象抗原表位，初步阐明了BTV VP7蛋白竞争抑制特异性的分... 详细信息

VP7蛋白作为蓝舌病病毒群特异性抗原，在BTV各个血清型中高度保守，而针对VP7蛋白的血清学检测方法也是当前检测BT的主要方法之一。本研究通过鉴定BTV VP7蛋白竞争抑制群特异性构象抗原表位，初步阐明了BTV VP7蛋白竞争抑制特异性的分子基础，这一结果对BT血清学检测方法的建立和改进具有重要的参考价值。

关键词：动物医学蓝舌病病毒蛋白表达群特异性抗原表位

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传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析

传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：朱向东王永山欧阳伟潘群兴毕振威李月华范红结王笑梅江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室

从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病(IBD)发病鸡群中分离到两株传染性法氏囊病病毒(IBDV),分别命名为QL和ZZ-11,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94%和86%。为分析该毒株的分子生物学特征,对其全基因组序列进行了测定,两个病毒株基因组... 详细信息

从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病(IBD)发病鸡群中分离到两株传染性法氏囊病病毒(IBDV),分别命名为QL和ZZ-11,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94%和86%。为分析该毒株的分子生物学特征,对其全基因组序列进行了测定,两个病毒株基因组A节段长度为3260bp、B节段长度2827bp。病毒演化分析结果显示两个病毒基因组A节段的核苷酸序列与已发表的强毒株序列的同源性分别为96.8%～98.1%和96.9%～98.4%,处在IBDV超强毒株分支上;而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89.7%～90.4%和90.0%～90.7%,位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明,QL和ZZ-11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、294I和299S,七肽基序为SWSASGS,均符合超强毒株的分子特征;而B节段777-782位核苷酸序列为GGTGCC,没有Kpn酶切位点,具有弱毒株的序列特点。以上分析结果表明,QL和ZZ-11为IBDV自然重配株,A节段源于超强毒株,而B节段源于弱毒株。

关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV) 病毒演化重配病毒序列分析

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gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

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动物生态养殖、疫病防控、食品安全与人类健康——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会

作者：欧阳伟朱向东王永山王永强潘群兴毕振威王笑梅江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

为研究microRNA(gga-miR-21)对传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制的影响,本研究利用PCR方法从鸡的肝细胞基因组中扩增细胞pri-gga-miR-21,克隆于慢病毒表达质粒pL-EGFP中构建重组质粒pL-miR-21。将pL-miR-21和3个包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293FT细胞,制备含gga-miR-21基因的重组慢病毒VL+miR-21。用VL+miR-21感染DF-1细胞,经杀稻瘟菌素筛选获得了过表达gga-miR-21的细胞株DF-miR-21,用定量RT-PCR(qRT-PCR)检测表明,gga-miR-21的表达量比正常DF-1细胞提高60%。将IBDV接种于DF-miR-21细胞,在96h后,其病毒滴度(104.75TCID50/0.1mL)显著低于正常DF-1细胞的病毒滴度(108.75TCID50/0.1mL)。用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析验证,在IBDV基因组VP1基因中存在gga-miR-21的结合靶点。将IBDV感染的DF-miR-21细胞,用western blot分析,VP1蛋白的表达量比正常DF-1细胞显著降低;用qRT-PCR分析,VP1mRNA水平与正常DF-1细胞没有明显差异。本实验结果表明:细胞gga-miR-21可抑制IBDV的复制,其分子作用机理是在VP1基因翻译水平上实现的。

关键词：传染性法氏囊病病毒(IBDV) miRNA gga-miR-21 慢病毒表达系统病毒复制

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一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗株HuN4-F112N蛋白单克隆抗体不识别其强毒株HuN4-F5与其氨基酸序列无关

一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗株HuN4-F112N蛋白单克隆抗体...

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2013国际猪繁殖与呼吸综合征学术研讨会

作者：王倩安同庆彭金美陈家锃冷超粮孙艳田志军杨汉春中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验/室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 中国农业大学动物医学院农业部动物流行病学与人畜共患病重点实验室北京100193 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验/室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 中国农业大学动物医学院农业部动物流行病学与人畜共患病重点实验室北京100193

2006年,以Nsp2编码区30-aa缺失为特征的高致病性PRRSV (HP-PRRSV)的出现和流行给我国养猪业造成巨大的经济损失.本实验室通过将HP-PRRSV HuN4株在Marc-145细胞上传了112代得到一个致弱毒株HuN4-F112.序列分析显示HuN4-F112与其强毒株HuN...

2006年,以Nsp2编码区30-aa缺失为特征的高致病性PRRSV (HP-PRRSV)的出现和流行给我国养猪业造成巨大的经济损失.本实验室通过将HP-PRRSV HuN4株在Marc-145细胞上传了112代得到一个致弱毒株HuN4-F112.序列分析显示HuN4-F112与其强毒株HuN4-F5之间存在数目不多、散在的氨基酸突变,然而它的生物学特性已经发生了很大的改变.如何找出它们之间的抗原性差异对于研究它致弱的分子机制具有重要意义.

关键词：

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gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

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中国畜牧兽医学会禽病学分会第三届全国禽病分子生物技术青年学术论坛

作者：欧阳伟朱向东王永山王永强潘群兴毕振威王笑梅江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

用PCR 方法从鸡的肝细胞基因组中扩增细胞pri-gga-miR-21,克隆于慢病毒表达质粒pL-EGFP中构建重组质粒pL-miR-21.将pL-miR-21 和包装质粒共转染293FT 细胞,制备重组慢病毒VL+miR-21.用VL+miR-21感染DF-1 细胞,经杀稻瘟菌素筛选获得了过...

用PCR 方法从鸡的肝细胞基因组中扩增细胞pri-gga-miR-21,克隆于慢病毒表达质粒pL-EGFP中构建重组质粒pL-miR-21.将pL-miR-21 和包装质粒共转染293FT 细胞,制备重组慢病毒VL+miR-21.用VL+miR-21感染DF-1 细胞,经杀稻瘟菌素筛选获得了过表达gga-miR-21 的细胞株DF-miR-21,qRT-PCR 检测表明,gga-miR-21 的表达量比正常DF-1 细胞提高60％.

关键词：

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gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

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中国畜牧兽医学会家畜传染病分会第八次全国会员代表大会暨第15次学术研讨会

为研究microRNA(gga-miR-21)对传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制的影响,本研究利用PCR方法从鸡的肝细胞基因组中扩增细胞pri-gga-miR-21,克隆于慢病毒表达质粒pL-EGFP中构建重组质粒pL-miR-21.将pL-miR-21和3个包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293FT细胞,制备含gga-miR-21基因的重组慢病毒VL+miR-21.用VL+miR-21感染DF-1细胞,经杀稻瘟菌素筛选获得了过表达gga-miR-21的细胞株DF-miR-21,用定量RT-PCR(qRT-PCR)检测表明,gga-miR-21的表达量比正常DF-1细胞提高60％。将IBDV接种于DF-miR-21细胞,在96 h后,其病毒滴度(104.75TCID50/0.1mL)显著低于正常DF-1细胞的病毒滴度(108.75TCID50/0.1mL).用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析验证,在IBDV基因组VP1基因中存在gga-miR-21的结合靶点。将IBDV感染的DFmiR-21细胞,用western blot分析,VP1蛋白的表达量比正常DF-1细胞显著降低;用qRT-PCR分析,VP1 mRNA水平与正常DF-1细胞没有明显差异。本实验结果表明:细胞gga-miR-21可抑制IBDV的复制,其分子作用机理是在VP1基因翻译水平上实现的。

关键词：鸡传染性法氏囊病病毒复制细胞株基因表达

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传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析

传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析

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中国畜牧兽医学会家畜传染病分会第八次全国会员代表大会暨第15次学术研讨会

作者：朱向东王永山欧阳伟潘群兴毕振威李月华范红结王笑梅江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心江苏南京210014 南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病(IBD)发病鸡群中分离到两株传染性法氏囊病病毒(IBDV),分别命名为QL和ZZ-11,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94％和86％。为分析该毒株的分子生物学特征,对其全基因组序列进行了测定,两个病毒株基因... 详细信息

从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病(IBD)发病鸡群中分离到两株传染性法氏囊病病毒(IBDV),分别命名为QL和ZZ-11,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94％和86％。为分析该毒株的分子生物学特征,对其全基因组序列进行了测定,两个病毒株基因组A节段长度为3260bp、B节段长度2827bp.病毒演化分析结果显示两个病毒基因组A节段的核苷酸序列与已发表的强毒株序列的同源性分别为96.8％～98.1％和96.9％～98.4％,处在IBDV超强毒株分支上;而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89.7％～90.4％和90.0％～90.7％,位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明,QL和ZZ-11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、294I和299S,七肽基序为SWSASGS,均符合超强毒株的分子特征;而B节段777-782位核苷酸序列为GGTGCC,没有KpnI酶切位点,具有弱毒株的序列特点。以上分析结果表明,QL和ZZ-11为IBDV自然重配株,A节段源于超强毒株,而B节段源于弱毒株。

关键词：鸡传染性法氏囊病病毒基因组结构序列分析分离鉴定

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传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析

传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析

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中国畜牧兽医学会禽病学分会第三届全国禽病分子生物技术青年学术论坛

从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病(IBD)发病鸡群中分离到两株传染性法氏囊病病毒(IBDV),命名为QL和ZZ-11,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94％和86％。

关键词：

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禽流感病毒H5亚型HA基因在杆状病毒系统中的表达及生物学活性鉴定

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中国预防兽医学报 2012年第7期34卷 523-526页

作者：赵双成常晓飞田石柳金雄陈普成田国彬邓国华姜永萍陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究禽流感病毒(AIV)HA蛋白抗原活性,本研究将A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)的HA基因片段克隆于pFastBacHTA中,构建重组质粒pFastBacHTA-HA,转化至DH10Bac感受态细胞,构建重组杆粒,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。... 详细信息

为研究禽流感病毒(AIV)HA蛋白抗原活性,本研究将A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)的HA基因片段克隆于pFastBacHTA中,构建重组质粒pFastBacHTA-HA,转化至DH10Bac感受态细胞,构建重组杆粒,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。采用间接免疫荧光、western blot和血凝试验对所表达的蛋白进行抗原性和生物学活性分析。结果表明,表达重组蛋白分子量约为64 ku;IFA和western blot试验证明重组HA蛋白能够与H5亚型禽流感阳性血清特异结合,具有良好的抗原性;血凝试验和淋巴细胞增殖试验显示重组蛋白具有良好生物学活性。重组蛋白的正确表达为进一步研究HA基因功能活性和制备禽流感HA基因亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：禽流感 HA基因杆状病毒

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