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H5N1亚型禽流感病毒A／Anhui／2／2005活候选疫苗株的构建及其对鸡致病性的研究

中国预防兽医学报 2008年第11期30卷 831-835页

作者：樊树芳许传田索永兵陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室／兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018

A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗供体株具有冷适应性、温度敏感性和致弱性表型。本研究利用基因工程技术体外合成A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗株具有冷适应性的内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS,从A/Anhui/2/2005(H5N1)毒株... 详细信息

A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗供体株具有冷适应性、温度敏感性和致弱性表型。本研究利用基因工程技术体外合成A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗株具有冷适应性的内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS,从A/Anhui/2/2005(H5N1)毒株获得HA、NA,并对HA基因上的多个连续碱性氨基酸基序进行了缺失修饰。将上述8个基因片段分别克隆至pBD双向表达载体中测序鉴定。利用质粒反向遗传操作系统,将构建正确的8个重组pBD质粒转染Vero细胞拯救病毒。经RT-PCR和序列测定鉴定,结果表明本试验成功获得了一株H5N1亚型A/Anhui/2/2005重组病毒,将其命名为AH/AAca,救获的重组病毒具有预期的温度敏感性和冷适应性生物学特性。随后进行了AH/AAca人工感染SPF鸡的感染性和致病性试验,结果表明其对鸡既无感染性,也无致病性。AH/AAca的获得为评价其在小鼠、非人类灵长目等动物模型上的保护效力的研究打下了坚实基础,为我国预防人禽流感的流行建立了技术储备。

关键词：禽流感病毒反向遗传操作救获病毒冷适应性温度敏感性

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鸭源H5N1亚型禽流感病毒分离株的致病性及表面蛋白基因序列分析

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畜牧与兽医 2008年第11期40卷 17-20页

作者：杨德全李雁冰施建忠陈化兰张书霞南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室国家禽流感参考实验室黑龙江哈尔滨150001

分析1株2004年从广东省分离获得的HSN1型禽流感病毒株A／Duck／GuangdongJiedong／23／2004对SPF鸡和鸭的致病性，并对其血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因的序列进行测定，与GenBank中收录的其他序列进行比较。结果，此分离株对... 详细信息

分析1株2004年从广东省分离获得的HSN1型禽流感病毒株A／Duck／GuangdongJiedong／23／2004对SPF鸡和鸭的致病性，并对其血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因的序列进行测定，与GenBank中收录的其他序列进行比较。结果，此分离株对SPF鸡和鸭均具有高致病性，且致死率达100％。HA基因与SCK／ST／475／04的同源率最高，而NA基因与Ck／GD／178／04同源率最高。进化分析结果表明，此毒珠与DK／Chi—na／E319-2／03的HA、NA亲缘关系较近，推测它们来源于同一祖代毒株。推导的HA基因氨基酸裂解位点为-RRRKK-，具有典型高致病性禽流感的特征序列；NA基因颈部49～68位20个氨基酸缺失是近年来H5N1亚型优势流行株共同的遗传标志。

关键词：禽流感病毒 1-15N1亚型致病性血凝素神经氨酸酶序列分析

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禽流感基因诊断技术研究进展

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动物医学进展 2008年第8期29卷 60-62页

作者：田丽娜王秀荣杨忠苹石霖陶启蒙陈化兰东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

禽流感是由流感病毒引起的一种人和动物的高度传染性疾病,不但造成养禽业的巨大经济损失,还对人类公共卫生安全存在威胁。因此,快速、准确的基因诊断技术对于禽流感的防控显得非常重要。近年来,主要有RT-PCR技术、荧光定量RT-PCR技术、... 详细信息

禽流感是由流感病毒引起的一种人和动物的高度传染性疾病,不但造成养禽业的巨大经济损失,还对人类公共卫生安全存在威胁。因此,快速、准确的基因诊断技术对于禽流感的防控显得非常重要。近年来,主要有RT-PCR技术、荧光定量RT-PCR技术、核酸依赖扩增技术(NASBA)以及基因芯片等基因诊断技术。文章就这些方法的基本原理、检测优点以及应用现状进行综述,以期为有效控制禽流感的发生与流行提供有力技术支撑。

关键词：禽流感反转录-聚合酶链反应核酸依赖扩增技术基因芯片

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H5N1亚型禽流感病毒HA基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究

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动物医学进展 2008年第7期29卷 13-18页

作者：陈浩刘明刘春国杨涛李洪涛杜金玲孙恩成东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆163319

采用RT-PCR技术扩增了高致病性禽流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)HA基因,然后将其克隆到真核表达载体pCI-neo中,获得重组质粒pCI-HA。在脂质体介导下转染Vero细胞,单抗免疫组化IPMA结果表明,HA蛋白在VeroE6细胞上大量表达。pCI-HA质... 详细信息

采用RT-PCR技术扩增了高致病性禽流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)HA基因,然后将其克隆到真核表达载体pCI-neo中,获得重组质粒pCI-HA。在脂质体介导下转染Vero细胞,单抗免疫组化IPMA结果表明,HA蛋白在VeroE6细胞上大量表达。pCI-HA质粒在有或无脂质体佐剂存在下以50μg剂量免疫接种Balb/c小鼠和SPF鸡,对照组只接种50μgpCI-neoDNA,各组以相同剂量加强免疫两次,每次免疫间隔3周。每次免疫前采集血清用ELISA检测抗体效价。最后一次免疫后3周用106EID50的高致病性流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)进行攻毒试验。免疫组小鼠抗体效价与对照组相比明显升高,但脂质体佐剂免疫组与非脂质体免疫组小鼠抗体效价差异不显著,基因免疫组小鼠能够抵抗H5N1高致病性禽流感病毒的致死性攻击。该核酸疫苗虽然能够诱导SPF鸡产生抗体应答,但抗体产生缓慢,效价较低。

关键词：禽流感病毒 HA基因核酸疫苗免疫效力

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H3N2亚型猪流感病毒HA基因序列测定及抗原性分析

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动物医学进展 2008年第3期29卷 5-9页

作者：刘大飞杨涛刘明刘春国桑学波刘大程中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江农垦总局畜牧兽医总站哈尔滨分站．黑龙江哈尔滨150038 莱阳市城厢兽医站山东莱阳265200

采用RT～PCR技术对4株H3N2亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增，将获得的PCR产物分别与pMD18-T克隆载体连接，进行序列测定。测序结果显示，4个毒株均含有完整的开放阅读框，并且均未发现核苷酸插入或缺失现象；分离毒株间核苷酸同源性... 详细信息

采用RT～PCR技术对4株H3N2亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增，将获得的PCR产物分别与pMD18-T克隆载体连接，进行序列测定。测序结果显示，4个毒株均含有完整的开放阅读框，并且均未发现核苷酸插入或缺失现象；分离毒株间核苷酸同源性为99．4％～99．7％，氨基酸同源性为98．2％～99．3％。同源性分析表明，4个毒株与2003年的猪流感病毒广东分离株有很高同源性（均在99％以上），说明近段时间我国H3N2亚型的猪流感病毒变异不大，重组的频率不是很高，同时又与人流感病毒香港分离株有较高的同源性（均为99．4％）。交叉血凝抑制试验显示，S3株与其他3毒株抗原性差异明显。鉴于猪在流感病毒传播与复制间的特殊地位，应密切监测猪流感。

关键词：猪流感病毒 HA基因克隆抗原性分析

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抗猪流感病毒H1亚型HA蛋白特异性单克隆抗体的研制

抗猪流感病毒H1亚型HA蛋白特异性单克隆抗体的研制

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：李洪涛刘明刘春国杜金铃孙恩成刘洋中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室东北农业大学黑龙江八一农垦大学

本试验构建了H1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)HA基因表达质粒,基因免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。通过ELISA、HI试验筛选阳性克隆。应用ELISA、HI试验和Western blot试... 详细信息

本试验构建了H1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)HA基因表达质粒,基因免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。通过ELISA、HI试验筛选阳性克隆。应用ELISA、HI试验和Western blot试验测定McAb的反应性和特异性。共获得3株分泌抗H1亚型猪流感病毒HA蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为8C4、8C6、9D6。McAb腹水ELISA效价在1:16000～1:256000之间;HI效价为1:512～1:256000;对A/Swine/Guangdong/LM/2004的中和效价分别为:10-2.83、10-6.4、10-5.8。Western blot分析结果显示,3株McAb只与H1亚型猪流感病毒HA蛋白反应。HA蛋白特异性McAb的研制为H1抗原变异分析及H1亚型猪流感诊断方法的建立奠定了物质基础。

关键词：猪流感基因免疫单克隆抗体血凝抑制

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H3N2亚型猪流感病毒的拯救

H3N2亚型猪流感病毒的拯救

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：杜金玲刘明杨涛刘春国李洪涛孙恩成万春和刘大飞陈浩齐金龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江八一农垦大学动物科技学院福建省农科院畜牧兽医研究所

利用反向遗传学操作技术,以A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株为亲本株,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分11段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,转染293T和MDCK共培养细胞,成功拯救出全部基因均来自于A/Swine/Henan/S4/01(H3... 详细信息

利用反向遗传学操作技术,以A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株为亲本株,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分11段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,转染293T和MDCK共培养细胞,成功拯救出全部基因均来自于A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)的猪流感病毒,生物学实验结果表明该拯救毒株在鸡胚半数感染量,组织培养半数感染量,稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。拯救的H3N2亚型猪流感病毒经鸡胚多次传代后血凝价最高可达到1颐256,在接种MDCK60h后,血凝价可达到1颐64。H3N2亚型猪流感病毒的拯救成功,为研究流感病毒突破种间屏障分子机制和猪流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。

关键词：猪流感 H3N2亚型反向遗传病毒拯救

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重组H5N3亚型禽流感细胞毒灭活疫苗免疫佐剂效果的评价

重组H5N3亚型禽流感细胞毒灭活疫苗免疫佐剂效果的评价

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：刘春国刘明刘大飞李洪涛杨涛孙恩成杜金玲中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室东北农业大学动物医学学院黑龙江八一农垦大学动物科技学院

为评价不同佐剂对疫苗免疫效果的影响,本试验以利用反向遗传操作技术拯救的重组H5N3亚型禽流感病毒疫苗株为种毒,对国产矿物油以及赛比克公司提供的MontanideTMISA 70M VG(简称70M)和MontanideTMISA 206 VG(简称206)三种佐剂制备的灭活... 详细信息

为评价不同佐剂对疫苗免疫效果的影响,本试验以利用反向遗传操作技术拯救的重组H5N3亚型禽流感病毒疫苗株为种毒,对国产矿物油以及赛比克公司提供的MontanideTMISA 70M VG(简称70M)和MontanideTMISA 206 VG(简称206)三种佐剂制备的灭活疫苗进行了SPF鸡免疫攻毒试验。结果表明国产矿物油佐剂组与70M佐剂组都能对SPF鸡100%保护,206佐剂组仅能保护40%SPF鸡不死亡;从抗体水平上比较发现70M佐剂组稍好于国产矿物油佐剂组,但两组差异不显著,而两组与206佐剂组差异极显著。该三种佐剂组免疫鸭均能够诱导产生较高的抗体水平,70M佐剂组优于国产矿物油佐剂组和206佐剂组,但三者差异不显著。用70M系的8种佐剂MontanideTMISA 70 essaiMi(i=1-8)(简称70Mi)佐剂乳化的疫苗免疫SPF鸡,结果表明70M佐剂组效果最好,攻毒后免疫鸡不排毒、不发病、不死亡,统计学分析显示70M佐剂组与所有70Mi佐剂组差异均显著。试验结果表明70M佐剂可以作为新型疫苗佐剂用于流感疫苗的制备。

关键词：禽流感 H5N1亚型细胞苗佐剂

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重组H5N3禽流感疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖条件研究

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中国预防兽医学报 2007年第3期29卷 199-203页

作者：杨涛刘明张云刘春国王洪峰蔡雪辉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究通过反义遗传学技术构建的重组禽流感病毒rH5N3疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖规律,确定最佳增殖条件,将rH5N3疫苗株分别在500mL和10L转瓶培养的MDCK细胞中进行增殖试验,检测不同接毒量以及接毒后不同时间里的血凝价,以确定病毒的... 详细信息

为研究通过反义遗传学技术构建的重组禽流感病毒rH5N3疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖规律,确定最佳增殖条件,将rH5N3疫苗株分别在500mL和10L转瓶培养的MDCK细胞中进行增殖试验,检测不同接毒量以及接毒后不同时间里的血凝价,以确定病毒的增殖情况。结果表明,在确定的最佳病毒增殖条件下,该重组rH5N3疫苗株在500mL转瓶和10L转瓶中可获得大量增殖,病毒的最高血凝价均可达到1∶1024。rH5N3疫苗株可以在MDCK细胞中大规模增殖,操作方法简便,成本低廉,该方法为禽流感细胞培养型疫苗的大规模生产奠定了基础。

关键词：禽流感细胞培养 MDCK细胞

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猪流感抗体间接ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2007年第4期29卷 308-311页

作者：陈艳辛晓光杨焕良李婷李海燕乔传玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

猪流感病毒A/Swine/Fujian/668/2001(H3N2)株感染的鸡胚尿囊液,经差速离心后,再经蔗糖密度梯度离心,提纯、纯化的猪流感病毒经NP-40处理并反复冻融,作为猪流感间接ELISA抗原,确立了间接ELISA检测方法。对29份HI试验猪流感为阴性的血清... 详细信息

猪流感病毒A/Swine/Fujian/668/2001(H3N2)株感染的鸡胚尿囊液,经差速离心后,再经蔗糖密度梯度离心,提纯、纯化的猪流感病毒经NP-40处理并反复冻融,作为猪流感间接ELISA抗原,确立了间接ELISA检测方法。对29份HI试验猪流感为阴性的血清进行了检测,经统计学分析,确定间接ELISA判定标准,被检血清OD_(490nm)值≥0.20判定为阳性。该方法对猪瘟等11种猪疫病阳性血清无交叉反应,批内和批间重复试验的吸收变异系数分别在3.34%～8.12%和6.2%～9.04%之间。与HI的符合率达到92.8%,经卡方检验(P<0.01)比HI试验敏感。为猪流感抗体检测提供了快速、准确、简便的方法。

关键词：猪流感猪流感病毒间接ELISA

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