检索结果-内蒙古大学图书馆

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NP基因在昆虫细胞中的表达及其表达产物的生物学活性

中国兽医科学 2008年第5期38卷 380-385页

作者：万春和刘明刘春国杨涛刘大飞齐金龙陈浩杜金铃李洪涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

根据GenBank上登录的H5N1亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)核蛋白(NP)基因序列设计引物,通过PCR扩增出A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)毒株的NP基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,将筛选的阳性重组转座载体pFastBacGP67B-NP转化... 详细信息

根据GenBank上登录的H5N1亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)核蛋白(NP)基因序列设计引物,通过PCR扩增出A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)毒株的NP基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,将筛选的阳性重组转座载体pFastBacGP67B-NP转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,构建了杆状病毒表达载体,获得了重组转座子(rBacmid-NP),在脂质体介导下转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBv-NP)。SDS-PAGE分析、Western-blotting检测、免疫组化分析和ELISA试验结果表明,分子质量约为54 ku的重组核蛋白得到了高效表达,该表达蛋白具有良好的生物学活性。

关键词：禽流感病毒核蛋白基因昆虫细胞杆状病毒表达

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H3N2亚型猪流感病毒实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

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中国兽医科学 2009年第10期39卷 894-899页

作者：陈艳张春明乔传玲杨焕良张飞吴运谱辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

根据H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因保守序列,分别设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光定量PCR技术检测SIV。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD18-H3HA、pMD18-... 详细信息

根据H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因保守序列,分别设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光定量PCR技术检测SIV。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD18-H3HA、pMD18-N2NA标准品绘制标准曲线,其相关系数分别为0.99015(H3HA)和0.99947(N2NA)。检测结果显示,该方法的敏感性可达100 copies/μL,除H3N2亚型SIV外,对H1亚型、H9亚型SIV以及猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒和猪2型圆环病毒的检测均为阴性,应用该方法对实验室感染样品进行检测,其结果与病毒分离结果的符合率为95.83%。表明,该方法特异性强、重复性好,有望成为H3N2亚型SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法。

关键词：猪流感病毒 H3N2亚型 Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR

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H3N8亚型马流感病毒拯救体系的建立

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中国兽医科学 2009年第5期39卷 377-382页

作者：杜金玲刘明刘春国李洪涛张新涛石薇琳中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

利用反向遗传学操作技术,以马流感病毒(EIV)A/Equine/Fuyun/2008/(H3N8)为亲本株,采用RT-PCR技术对该毒株的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,重组质粒转染293T和MDCK共培养细胞,成功拯救出全部基因均来自亲本株... 详细信息

利用反向遗传学操作技术,以马流感病毒(EIV)A/Equine/Fuyun/2008/(H3N8)为亲本株,采用RT-PCR技术对该毒株的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,重组质粒转染293T和MDCK共培养细胞,成功拯救出全部基因均来自亲本株的EIVrH3N8,生物学试验结果表明,rH3N8在鸡胚半数感染量、组织培养半数感染量、稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。以猪流感病毒(SIV)A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)内部基因的重组阳性质粒替换rH3N8的相应基因,成功拯救出重组病毒rgH3N8。两拯救毒株经鸡胚一次传代的血凝效价分别为1∶32、1∶64,最高可达1∶1024、1∶2048;接种MDCK细胞54h后的血凝效价最高均可达1∶512。rH3N8亚型EIV的成功拯救及基因的成功替换,为流感病毒突破种间屏障分子机制的研究和流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。

关键词：马流感病毒反向遗传反转录聚合酶链式反应 H3N8亚型病毒拯救

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禽网状内皮组织增殖病病毒对禽流感疫苗免疫效果的影响

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中国预防兽医学报 2015年第4期37卷 291-294页

作者：白洁曾显营祁小乐李鑫李倩倩陈化兰田国彬中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)对禽流感病毒(AIV)疫苗免疫效果的影响,本研究将1日龄SPF鸡经腹腔感染REV HLJR0901株后,分别于10日龄免疫重组AIV灭活疫苗(H5N1亚型,Re-6)、禽流感-新城疫重组二联活疫苗(r LH5-6)及10日龄和24日龄... 详细信息

为研究禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)对禽流感病毒(AIV)疫苗免疫效果的影响,本研究将1日龄SPF鸡经腹腔感染REV HLJR0901株后,分别于10日龄免疫重组AIV灭活疫苗(H5N1亚型,Re-6)、禽流感-新城疫重组二联活疫苗(r LH5-6)及10日龄和24日龄两次免疫r LH5-6疫苗,并设未感染REV的免疫对照组,于免疫后检测血清HI抗体,并采用H5N1亚型高致病性AIV攻毒。结果显示:实验鸡感染REV后HI抗体滴度均低于相应的未感染REV的免疫对照组。感染REV后,免疫一次Re-6灭活疫苗、r LH5-6活疫苗及两次r LH5-6活疫苗的实验鸡攻毒后的存活率分别为70%、60%及80%,排毒鸡数分别为4/10、4/10及3/10;未感染REV的免疫鸡均不发病、不死亡、不排毒;空白对照组实验鸡攻毒后3 d内全部死亡并且排毒。本研究表明,REV对AIV灭活疫苗和活疫苗均具有明显的免疫抑制作用,加强免疫r LH5-6疫苗可以部分减轻该抑制作用。

关键词：禽网状内皮组织增殖病病毒禽流感疫苗免疫效果影响

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禽白血病病毒对禽流感疫苗免疫效果的影响

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中国预防兽医学报 2016年第5期38卷 394-397页

作者：李鑫曾显营高玉龙白洁石文军陈化兰田国彬中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点开放实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究禽白血病病毒(ALV)对禽流感(AI)疫苗免疫效果的影响,本研究将1日龄SPF鸡经腹腔接种ALV HLJ09DH02株后,于21日龄免疫重组禽流感病毒(AIV)灭活疫苗(H5N1亚型,Re-8)或禽流感-新城疫重组二联活疫苗(r LH5-8),免疫后与未感染ALV的免疫... 详细信息

为研究禽白血病病毒(ALV)对禽流感(AI)疫苗免疫效果的影响,本研究将1日龄SPF鸡经腹腔接种ALV HLJ09DH02株后,于21日龄免疫重组禽流感病毒(AIV)灭活疫苗(H5N1亚型,Re-8)或禽流感-新城疫重组二联活疫苗(r LH5-8),免疫后与未感染ALV的免疫对照鸡同时检测血清HI抗体并采用H5N1亚型高致病性AIV攻毒。结果显示:实验鸡感染ALV后HI抗体滴度均显著低于相应的未感染ALV的免疫对照组(p<0.05)。感染ALV后,免疫Re-8灭活疫苗及其对照组攻毒后的排毒鸡数分别为4/10和0/10,存活率分别为90%和100%;感染ALV后,免疫r LH5-8活疫苗及其对照组攻毒后的排毒鸡数分别为10/10和0/10,存活率分别为0和100%;未感染ALV的AI免疫鸡均不发病、不死亡、不排毒;空白对照鸡攻毒后3 d内全部死亡并且排毒。本研究表明,ALV对AI灭活疫苗和活疫苗均具有显著免疫抑制作用,建议加强种鸡ALV的净化,降低对AI等疫苗免疫效果的影响。

关键词：禽白血病禽流感疫苗免疫效果影响

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重组SEA增强H5亚型禽流感灭活疫苗对肉鸡的免疫效果研究

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中国预防兽医学报 2012年第5期34卷 393-396页

作者：苏文曾显营田国彬杨婧张盼涛王彦妮陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为评价重组葡萄球菌肠毒素A(rSEA)对H5亚型禽流感病毒(AIV)灭活疫苗免疫效果的影响,本研究以原核表达的rSEA为免疫增强剂,制备成含有rSEA高(167μg/0.5 mL)、低(16.7μg/0.5 mL)两种剂量的AIV油乳剂灭活苗,分别免疫7 d龄肉鸡,通过检测... 详细信息

为评价重组葡萄球菌肠毒素A(rSEA)对H5亚型禽流感病毒(AIV)灭活疫苗免疫效果的影响,本研究以原核表达的rSEA为免疫增强剂,制备成含有rSEA高(167μg/0.5 mL)、低(16.7μg/0.5 mL)两种剂量的AIV油乳剂灭活苗,分别免疫7 d龄肉鸡,通过检测免疫鸡AIV HI抗体滴度及外周血CD4+/CD8+值评价其免疫效果。HI抗体检测结果显示,免疫后2周高剂量组HI抗体平均滴度为5.6 log2,低剂量组为4.2 log2,而无rSEA疫苗对照组为2.9 log2(p<0.01);同时在免疫后前4周,rSEA免疫组的HI抗体平均滴度及峰值与对照组相比均差异显著(p<0.05)。T淋巴细胞亚群检测结果显示,肉鸡免疫高剂量rSEA的灭活苗后,其外周血CD4+百分含量及CD4+/CD8+值均显著高于对照组(p<0.05)。上述结果表明,rSEA作为AIV灭活苗免疫增强剂,能够快速诱导较高的HI抗体滴度,同时也可增强细胞免疫反应,有效缩短免疫空白期,使肉鸡短时间内产生较强的免疫应答反应。

关键词：禽流感灭活疫苗 rSEA 免疫增强剂肉鸡

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表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白重组新城疫病毒的构建以及密码子优化的HA免疫增强作用

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中国预防兽医学报 2014年第8期36卷 585-589页

作者：陈曦于桂梅刘景利王金良姜永萍葛金英步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为构建表达H5N1亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白重组新城疫病毒(NDV)及比较密码子优化的HA免疫增强作用,本研究利用NDV LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统,分别构建了表达野毒型H5N1亚型AIV HA蛋白和密码子优化的HA蛋白的重组NDV,并分别命... 详细信息

为构建表达H5N1亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白重组新城疫病毒(NDV)及比较密码子优化的HA免疫增强作用,本研究利用NDV LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统,分别构建了表达野毒型H5N1亚型AIV HA蛋白和密码子优化的HA蛋白的重组NDV,并分别命名为rL-H5HA和rL-optiH5HA。对拯救的重组病毒进行RT-PCR、间接免疫荧光和western blot鉴定,结果表明,两种重组病毒均可以在BHK-21细胞中以及鸡胚成纤维细胞稳定地表达HA蛋白。此外,rL-optiH5HA在体外增殖能力及在体内刺激产生抗体均显著高于rL-H5HA。本研究表明,密码子优化的HA重组NDV具有明显的免疫增强作用。本研究为研制安全、有效的新型禽流感疫苗提供了实验依据。

关键词：禽流感病毒 HA蛋白重组新城疫病毒密码子优化

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不同攻毒剂量对评估H9亚型禽流感疫苗免疫效果的影响

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中国预防兽医学报 2017年第4期39卷 301-305页

作者：石文军曾显营臧金凯吴姣姣白洁陈化兰田国彬中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

为了解不同攻毒剂量对评估H9亚型禽流感疫苗免疫效果的影响,本研究选取禽流感病毒(AIV)CK/Hu N/174/08和CK/Hu B/S4196/09株制备成灭活疫苗免疫21日龄SPF鸡,免疫后采血检测血凝抑制(HI)抗体,免疫后3周时分别采用这两株亲本病毒经鼻腔途... 详细信息

为了解不同攻毒剂量对评估H9亚型禽流感疫苗免疫效果的影响,本研究选取禽流感病毒(AIV)CK/Hu N/174/08和CK/Hu B/S4196/09株制备成灭活疫苗免疫21日龄SPF鸡,免疫后采血检测血凝抑制(HI)抗体,免疫后3周时分别采用这两株亲本病毒经鼻腔途径攻毒。HI抗体测定结果显示:两株疫苗免疫21 d时,平均HI抗体滴度均可达10 log2以上,表明这两株病毒均具有良好的免疫原性。测定每0.1 mL CK/Hu N/174/08株病毒EID_(50)和CID_(50)分别为10^(-9.25)和10^(-3.88),CK/Hu B/S4196/09株为10^(-8.68)和10^(-5.38)。分别以10~6 EID_(50)、10 CID_(50)及10~2 CID_(50)剂量攻毒,CK/Hu N/174/08株和CK/Hu B/S4196/09株疫苗对亲本病毒株攻击的保护率分别为100%和0、100%和80%与60%和0,表明依据EID_(50)和CID_(50)攻毒,CK/Hu N/174/08株疫苗可以得出免疫保护效果一致的结论,而CK/Hu B/S4196/09株疫苗免疫保护效果不一致。本研究表明,EID_(50)和CID_(50)均可以作为H9亚型禽流感疫苗攻毒剂量的参考依据,但以CID_(50)为依据更可靠;10 CID_(50)是最佳的攻毒剂量。本研究为科学评价H9亚型禽流感疫苗的攻毒保护效果提供了依据,对于研制疫苗时选择种毒株以及临床上选用有效疫苗均具有指导意义。

关键词：攻毒剂量 H9亚型禽流感疫苗免疫效果评估

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H5亚型禽流感DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5对高致病力禽流感病毒攻击的免疫保护

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畜牧兽医学报 2005年第11期36卷 1178-1182页

作者：姜永萍张洪波李呈军步志高于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 农业部畜牧兽医总站北京100026

对H5亚型禽流感DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5的免疫效果进行了研究。pCAGGoptiHA5分别以100和10μg剂量一次或两次免疫3周龄SPF鸡,首次免疫后4周以同样剂量和途径进行第二次免疫,一次免疫后4周、两次免疫后2周分别用100LD50的HPAIV A/Goose/... 详细信息

对H5亚型禽流感DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5的免疫效果进行了研究。pCAGGoptiHA5分别以100和10μg剂量一次或两次免疫3周龄SPF鸡,首次免疫后4周以同样剂量和途径进行第二次免疫,一次免疫后4周、两次免疫后2周分别用100LD50的HPAIV A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况,分别于攻毒后第3、5、7天采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体、NT抗体以及AGP抗体的动态变化。结果,100μg pCAGGoptiHA5一次免疫、100μg pCAGGoptiHA5两次免疫以及10μg pCAGGoptiHA5两次免疫均可对免疫鸡形成100%完全保护(不发病、不致死、不排毒),10μg剂量pCAGGoptiHA5一次免疫可对免疫鸡形成100%的保护(不发病、不致死),结果表明,pCAGGoptiHA5作为疫苗效果良好、成本低廉,有望成为预防H5亚型高致病力禽流感的高效、安全新型基因工程疫苗。

关键词：禽流感 H5亚型 DNA疫苗pCAGGoptiHA5 免疫保护

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密码子的鸡体偏嗜性优化增强H5亚型禽流感HA基因的表达水平和免疫原性

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免疫学杂志 2005年第5期21卷 377-381页

作者：姜永萍张洪波李呈军步志高张芳芳于康震陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 农业部畜牧兽医总站北京100026

目的用鸡偏嗜性密码子替换H5亚型禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的保护性免疫原HA基因的密码子,优化和构建了基因optiHA5,以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。方法利用寡核苷酸合成、重叠延伸... 详细信息

目的用鸡偏嗜性密码子替换H5亚型禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的保护性免疫原HA基因的密码子,优化和构建了基因optiHA5,以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。方法利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR法及限制酶切法构建了密码子优化的HA基因(optiHA5),并将其插入表达载体pCI构建了DNA疫苗质粒pCIoptiHA5;将pCIoptiHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白;随之将pCIoptiHA5及pCIHA5分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后用100LD50的HPAIVGD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。结果间接免疫荧光法和Western-blot分析表明基因optiHA5表达水平显著高于野生型HA基因;免疫SPF鸡后,100μgpCIoptiHA5可形成75%的免疫保护,100μgpCIHA5可形成50%的免疫保护;10μgpCIoptiHA5可形成对免疫鸡75%的部分免疫保护,而10μgpCIHA5则基本不能形成免疫保护;pCIopti-HA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。结论试验结果表明,HA基因密码子的优化可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,提高免疫原性,增强免疫保护效果。

关键词：禽流感 H5亚型密码子优化的HA基因 DNA疫苗免疫保护

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