检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2009年第4期25卷 496-502页

作者：陈伟业曲林茂胡森胡倩倩张倩支海兵黄克和步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨150001 南京农业大学动物医学院南京210095 中国兽医药品监察所北京100081

本研究旨在构建表达小反刍兽疫H蛋白的重组山羊痘病毒,并评价其免疫效力。利用筛选基因gpt和eGFP并结合空斑技术,纯化筛选了重组小反刍兽疫H基因的重组山羊痘病毒(rGPV-PPRV-H),经过PCR鉴定重组病毒已纯化。免疫荧光和蛋白印迹都表明重... 详细信息

本研究旨在构建表达小反刍兽疫H蛋白的重组山羊痘病毒,并评价其免疫效力。利用筛选基因gpt和eGFP并结合空斑技术,纯化筛选了重组小反刍兽疫H基因的重组山羊痘病毒(rGPV-PPRV-H),经过PCR鉴定重组病毒已纯化。免疫荧光和蛋白印迹都表明重组病毒能够感染绵羊羔羊睾丸细胞表达小反刍兽疫H蛋白。以2×106PFU的rGPV-PPRV-H皮内注射免疫山羊6只,并于首次免疫后28d以相同剂量进行二次免疫。免疫后采血分离血清进行病毒中和试验,结果表明,一次免疫后21d,山羊痘病毒中和抗体效价依次为40、80、≥80、≥80、40、≥80,和小反刍兽疫病毒中和抗体效价全部转阳依次为80、80、80、80、40、40、10;二次免疫后14d,山羊痘病毒中和抗体效价抗体全部大于或等于80,小反刍兽疫病毒中和抗体效价依次为≥80、80、≥80、80、80、40,应该具有对山羊痘病毒和小反刍兽疫病毒强毒攻击的完全免疫保护作用。本研究为小反刍兽疫重组山羊痘疫苗的产业化提供了参考。

关键词：重组疫苗小反刍兽疫山羊痘病毒载体中和抗体

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以GPT和GFP为双重筛选标记的禽痘病毒转移载体的构建及鉴定

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中国预防兽医学报 2009年第7期31卷 501-504页

作者：王艳丽李俊辉姜永萍夏俊裴磊冉多良陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学院新疆乌鲁木齐830052

为研制和开发以禽痘病毒为载体的重组病毒疫苗,本研究构建了禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt,该载体含有gfp和gpt2种报告基因及背对的痘苗病毒晚期启动子P11和早期启动子P7.5,P11启动gfp和gpt两个基因,P7.5用于启动外源基因,在早期... 详细信息

为研制和开发以禽痘病毒为载体的重组病毒疫苗,本研究构建了禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt,该载体含有gfp和gpt2种报告基因及背对的痘苗病毒晚期启动子P11和早期启动子P7.5,P11启动gfp和gpt两个基因,P7.5用于启动外源基因,在早期启动子P7.5下游引入NotⅡ和AflⅡ两个酶切位点,用于外源基因的插入。为检测禽痘病毒转移载体pSY681-gfp-gpt的有效性,将H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/10/01(H9N2)的HA基因插入到该载体中构建转移载体pSY681-gfp-gpt-HA9,将转移载体转染已感染禽痘病毒S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞,利用gfp和gpt同时进行双重筛选、数轮蚀斑纯化后获得了重组病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,通过PCR、westernblot鉴定,结果证明,获得了能稳定表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,为今后重组禽痘病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。

关键词：重组禽痘病毒绿色荧光蛋白黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶 HA基因

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密码子优化的H5亚型流感病毒HA基因重组质粒在哺乳动物细胞中的高效表达及其免疫原性的研究

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自然科学进展 2009年第8期19卷 813-818页

作者：刘春国刘明孙恩成李洪涛杜金玲张新涛石薇琳谢金鑫刘大飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室及国家禽流感参考实验室哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆163319

为了提高流感病毒血凝素(HA)基因的表达量及其免疫原性,按照哺乳动物偏爱密码子将A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)流感病毒的血凝素基因进行优化改造,然后插入到真核表达载体pCI-neo中,构建了真核表达质粒pCI-opti-HA.将此质粒和含野生HA基因... 详细信息

为了提高流感病毒血凝素(HA)基因的表达量及其免疫原性,按照哺乳动物偏爱密码子将A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)流感病毒的血凝素基因进行优化改造,然后插入到真核表达载体pCI-neo中,构建了真核表达质粒pCI-opti-HA.将此质粒和含野生HA基因的真核表达质粒pCI-wt-HA分别转染Vero或293T细胞,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和蛋白免疫印迹(WB)实验比较HA蛋白的表达量.将两种重组质粒免疫Balb/c小鼠,比较两者诱导的抗体产生水平.三次免疫后两周用强毒攻击,通过体温和体重变化评价两种重组质粒的免疫保护效果.IP-MA和WB实验结果表明:密码子优化后,HA蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平显著提高.酶联免疫吸附实验(ELISA)结果表明:小鼠免疫后密码子优化的重组质粒诱导的特异性抗体效价较高.攻毒试验结果表明:两种重组质粒均能够提供较好的保护.

关键词： H5亚型流感病毒 HA 密码子优化 DNA疫苗免疫效果

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H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的建立及高产细胞型疫苗株的拯救

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中国农业科学 2009年第5期42卷 1797-1804页

作者：刘大飞刘明刘春国杨涛万春和陈浩齐金龙杜金玲李洪涛孙恩成刘大程中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室东北农业大学动物医学院黑龙江八一农垦大学动物科技学院莱阳市城厢兽医站

【目的】建立H1N1亚型猪流感病毒反向遗传学操作系统及拯救出能够在动物传代细胞中高水平复制的H1N1亚型猪流感疫苗株。【方法】利用反向遗传操作技术,对猪流感病毒广东分离株进行拯救。【结果】首次成功拯救出全部片段均来自于亲本株... 详细信息

【目的】建立H1N1亚型猪流感病毒反向遗传学操作系统及拯救出能够在动物传代细胞中高水平复制的H1N1亚型猪流感疫苗株。【方法】利用反向遗传操作技术,对猪流感病毒广东分离株进行拯救。【结果】首次成功拯救出全部片段均来自于亲本株的猪流感病毒rH1N1,并且成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株re-LM株,研究结果表明二者均具有良好的遗传稳定性。rH1N1经MDCK细胞连续传代培养后,血凝价最高仅为1:64;而re-LM的血凝价最高可以稳定在1:1024,表明该毒株具有细胞繁殖高产的特性。用该重组病毒制备油乳剂灭活苗免疫2月龄仔猪,首免2周即可检测出HI抗体,平均效价在1:32以上,三免后2周HI抗体平均效价达到1:512,说明其有良好的免疫原性。【结论】H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;重组细胞高产型猪流感病毒株的拯救为H1N1亚型猪流感疫苗的研制开辟了新的途径。

关键词：猪流感 H1N1亚型反向遗传操作技术细胞培养型流感疫苗

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猪流感病毒HA基因的克隆及杆状病毒转移载体的构建

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生物技术通报 2009年第9期25卷 97-100页

作者：赵朴郑玉姝贾贝贝乔传玲陈化兰刘兴友李海燕河南科技学院动物科学学院新乡453003 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001

猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)不仅给养猪业造成重大经济损失,而且威胁人类健康。血凝素(hemag-glutinin,HA)是SIV囊膜上的重要免疫原,介导病毒吸附和膜融合。针对流感病毒的中和抗体主要以HA靶标阻断受体结合,本研究通过RT-PC... 详细信息

猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)不仅给养猪业造成重大经济损失,而且威胁人类健康。血凝素(hemag-glutinin,HA)是SIV囊膜上的重要免疫原,介导病毒吸附和膜融合。针对流感病毒的中和抗体主要以HA靶标阻断受体结合,本研究通过RT-PCR扩增了猪流感病毒A/Swine/Inner Mongolia/547/01(H3N2)的HA基因,并将其克隆入pMD18-T载体。重组pMD18-T经KpnI和PstI酶切后得到的HA基因插入pMelBacA载体的KpnI/PstI位点。PCR和限制性内切酶分析鉴定表明成功构建了pMelBacA-HA转移载体。这为开发HA亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：猪流感病毒 HA基因克隆转移载体

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猪流感疫苗的研究进展

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黑龙江畜牧兽医 2009年第6期 32-33页

作者：刘大飞刘明刘春国杨涛刘大程中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 莱阳市城厢兽医站山东莱阳265200

猪流感（swine influenza，SI）是由流感病毒引起的一种严重呼吸道疾病，临床以突发、高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭、高发病率、低死亡率为特征。迄今已发现的A型猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）有H1N1、H1N2、H1N7、H3N1、H3N... 详细信息

猪流感（swine influenza，SI）是由流感病毒引起的一种严重呼吸道疾病，临床以突发、高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭、高发病率、低死亡率为特征。迄今已发现的A型猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）有H1N1、H1N2、H1N7、H3N1、H3N2、 H3N3、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2等10种不同血清亚型。自被发现以来，猪流感已成为严重危害猪群的疾病之一，已遍及亚洲、欧洲、非洲、南美洲、北美洲等，可谓全球流行。目前，世界范围内流行的猪流感血清型主要有人源H3N2、经典猪H1N1和类禽源H1N13种。

关键词：猪流感病毒流感疫苗呼吸道疾病 virus 呼吸困难血清亚型 H9N2 H5N1

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蓝舌病病毒VP7基因的原核表达

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中国预防兽医学报 2009年第12期31卷 925-928页

作者：宋红梅杨涛马健男王群张维军徐青元杨增岐吴东来西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为获得蓝舌病病毒(BTV)VP7基因的原核表达蛋白,本实验采用RT-PCR方法扩增出了血清1型BTV的VP7基因,并克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,构建了重组质粒pMAL-VP7。将重组质粒转化TB1感受态细胞,以0.5mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳... 详细信息

为获得蓝舌病病毒(BTV)VP7基因的原核表达蛋白,本实验采用RT-PCR方法扩增出了血清1型BTV的VP7基因,并克隆到原核表达载体pMAL-c2X中,构建了重组质粒pMAL-VP7。将重组质粒转化TB1感受态细胞,以0.5mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白MBP-VP7以可溶形式存在,分子质量约为90ku。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,初步建立了检测BTV血清抗体的间接ELISA诊断方法,为今后进一步开展BTV诊断研究奠定了基础。

关键词：蓝舌病病毒 VP7基因原核表达

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猪流感病毒NP基因的克隆及杆状病毒转移载体的构建

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西南农业学报 2009年第5期22卷 1453-1455页

作者：赵朴郑玉姝贾贝贝乔传玲陈化兰刘兴友李海燕河南科技学院动物科学学院河南新乡453003 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

本研究通过RT-PCR扩增了猪流感病毒A/Swine/Inner Mongolia/547/01(H3N2)的NP基因,并将其克隆入pMD18-T载体。重组pMD18-T经SalI和EcoR I酶切后得到的NP基因插入pMelBacB载体的SalI/EcoRI位点。PCR和限制性内切酶分析鉴定表明成功构建了... 详细信息

关键词：猪流感病毒 NP基因克隆转移载体

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表达小反刍兽疫病毒F蛋白的重组山羊痘病毒疫苗的研究

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中国预防兽医学报 2009年第6期31卷 415-420页

作者：曲林茂陈伟业胡倩倩胡森张倩支海兵黄克和步志高南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 中国兽医药品监察所北京100081

本研究利用gpt筛选基因和eGFP报告基因纯化筛选重组小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的重组山羊痘病毒(rGPV-PPRV-F),并经过PCR鉴定。免疫荧光和蛋白印迹试验都证实重组病毒能够感染绵羊羔羊睾丸细胞并表达PPRVF蛋白。以2×106PFU的rGPV-P... 详细信息

本研究利用gpt筛选基因和eGFP报告基因纯化筛选重组小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的重组山羊痘病毒(rGPV-PPRV-F),并经过PCR鉴定。免疫荧光和蛋白印迹试验都证实重组病毒能够感染绵羊羔羊睾丸细胞并表达PPRVF蛋白。以2×106PFU的rGPV-PPRV-F皮内注射免疫山羊3只,并于首次免疫后第28d以相同剂量进行二次免疫。分别于一免后21d和二免后14d采血后分离血清进行病毒中和试验。结果表明,一免后21d山羊痘病毒(GPV)中和抗体效价依次为1∶40、≥1∶80、≥1∶80,PPRV中和抗体效价依次别为1∶20、1∶40、1∶20,全部阳转;二免后14d,GPV中和抗体效价≥1∶80,PPRV中和抗体效价依次为1∶20、1∶80、1∶40。本研究为小反刍兽疫重组山羊痘疫苗的产业化奠定了基础。

关键词：小反刍兽疫 F蛋白山羊痘病毒载体重组疫苗中和抗体

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禽流感、新城疫可目视化诊断蛋白芯片的制备及初步应用

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中国预防兽医学报 2009年第1期31卷 60-64页

作者：石霖王秀荣杨忠苹陶启蒙王煜武嘉男蔡冬冬包红梅陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室／兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 重庆出入境检验检疫局重庆400020

本研究制备了可以同时鉴别诊断禽流感(AI)、新城疫(ND)2种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片。以超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了2种病毒蛋白抗原,用点样缓冲液稀释后点于醛基修饰的片基上,制备蛋白芯片;将芯片与待检血清杂交后,再与... 详细信息

本研究制备了可以同时鉴别诊断禽流感(AI)、新城疫(ND)2种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片。以超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了2种病毒蛋白抗原,用点样缓冲液稀释后点于醛基修饰的片基上,制备蛋白芯片;将芯片与待检血清杂交后,再与胶体金标记的二抗杂交,银染显色后根据灰度值判定结果,从而建立了2种禽病的可视化蛋白芯片鉴别诊断方法。采用该方法对18份现地血清样品进行初步检测,结果显示该芯片可特异性的与相应的抗体杂交,无交叉反应,而且呈现较强的杂交信号,其信号灰度值在阳性血清浓度为50μg/mL～300μg/mL范围内成线性关系(Y=0.426X+4.225)。用该芯片方法和琼扩(AGP)抗体检测方法对18份现地样品进行符合率检测,结果表明该可视化蛋白芯片具有很好的特异性,并且检测灵敏度为是AGP方法的400倍以上。研究表明该方法可用于同步鉴别2种禽病,是一种有效的抗体检测新方法。

关键词：禽流感新城疫可视化诊断蛋白芯片

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