检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：张春明乔传玲陈艳杨焕良辛晓光陈化兰冉多良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室新疆农业大学动物医学学院

根据猪流感病毒(SIV)M基因的保守序列,使用Primer Express2.0软件设计并合成一套特异性引物和TaqMan MGB探针,建立了SIV M基因实时荧光定量PCR检测方法。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD-M标准品做标准曲线,结果表明:该方法的灵敏度1... 详细信息

根据猪流感病毒(SIV)M基因的保守序列,使用Primer Express2.0软件设计并合成一套特异性引物和TaqMan MGB探针,建立了SIV M基因实时荧光定量PCR检测方法。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD-M标准品做标准曲线,结果表明:该方法的灵敏度1EID50,标准曲线的相关系数为0.99949,组间与组内重复试验变异系数分别为0.21%,0.65%,除猪流感病毒外,其他5种猪病病毒检测均为阴性,样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均为100%,该方法特异性好、重复性佳,为SIV检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法。

关键词： SIV TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR

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抗猪流感病毒H1亚型HA蛋白特异性单克隆抗体的研制

抗猪流感病毒H1亚型HA蛋白特异性单克隆抗体的研制

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：李洪涛刘明刘春国杜金铃孙恩成刘洋中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室东北农业大学黑龙江八一农垦大学

本试验构建了H1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)HA基因表达质粒,基因免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。通过ELISA、HI试验筛选阳性克隆。应用ELISA、HI试验和Western blot试... 详细信息

本试验构建了H1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)HA基因表达质粒,基因免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。通过ELISA、HI试验筛选阳性克隆。应用ELISA、HI试验和Western blot试验测定McAb的反应性和特异性。共获得3株分泌抗H1亚型猪流感病毒HA蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为8C4、8C6、9D6。McAb腹水ELISA效价在1:16000～1:256000之间;HI效价为1:512～1:256000;对A/Swine/Guangdong/LM/2004的中和效价分别为:10-2.83、10-6.4、10-5.8。Western blot分析结果显示,3株McAb只与H1亚型猪流感病毒HA蛋白反应。HA蛋白特异性McAb的研制为H1抗原变异分析及H1亚型猪流感诊断方法的建立奠定了物质基础。

关键词：猪流感基因免疫单克隆抗体血凝抑制

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H5N1亚型禽流感病毒HA基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究

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动物医学进展 2008年第7期29卷 13-18页

作者：陈浩刘明刘春国杨涛李洪涛杜金玲孙恩成东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆163319

采用RT-PCR技术扩增了高致病性禽流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)HA基因,然后将其克隆到真核表达载体pCI-neo中,获得重组质粒pCI-HA。在脂质体介导下转染Vero细胞,单抗免疫组化IPMA结果表明,HA蛋白在VeroE6细胞上大量表达。pCI-HA质... 详细信息

采用RT-PCR技术扩增了高致病性禽流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)HA基因,然后将其克隆到真核表达载体pCI-neo中,获得重组质粒pCI-HA。在脂质体介导下转染Vero细胞,单抗免疫组化IPMA结果表明,HA蛋白在VeroE6细胞上大量表达。pCI-HA质粒在有或无脂质体佐剂存在下以50μg剂量免疫接种Balb/c小鼠和SPF鸡,对照组只接种50μgpCI-neoDNA,各组以相同剂量加强免疫两次,每次免疫间隔3周。每次免疫前采集血清用ELISA检测抗体效价。最后一次免疫后3周用106EID50的高致病性流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)进行攻毒试验。免疫组小鼠抗体效价与对照组相比明显升高,但脂质体佐剂免疫组与非脂质体免疫组小鼠抗体效价差异不显著,基因免疫组小鼠能够抵抗H5N1高致病性禽流感病毒的致死性攻击。该核酸疫苗虽然能够诱导SPF鸡产生抗体应答,但抗体产生缓慢,效价较低。

关键词：禽流感病毒 HA基因核酸疫苗免疫效力

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H3N2亚型猪流感病毒HA基因序列测定及抗原性分析

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动物医学进展 2008年第3期29卷 5-9页

作者：刘大飞杨涛刘明刘春国桑学波刘大程中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江农垦总局畜牧兽医总站哈尔滨分站．黑龙江哈尔滨150038 莱阳市城厢兽医站山东莱阳265200

采用RT～PCR技术对4株H3N2亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增，将获得的PCR产物分别与pMD18-T克隆载体连接，进行序列测定。测序结果显示，4个毒株均含有完整的开放阅读框，并且均未发现核苷酸插入或缺失现象；分离毒株间核苷酸同源性... 详细信息

采用RT～PCR技术对4株H3N2亚型猪流感病毒的HA基因进行了扩增，将获得的PCR产物分别与pMD18-T克隆载体连接，进行序列测定。测序结果显示，4个毒株均含有完整的开放阅读框，并且均未发现核苷酸插入或缺失现象；分离毒株间核苷酸同源性为99．4％～99．7％，氨基酸同源性为98．2％～99．3％。同源性分析表明，4个毒株与2003年的猪流感病毒广东分离株有很高同源性（均在99％以上），说明近段时间我国H3N2亚型的猪流感病毒变异不大，重组的频率不是很高，同时又与人流感病毒香港分离株有较高的同源性（均为99．4％）。交叉血凝抑制试验显示，S3株与其他3毒株抗原性差异明显。鉴于猪在流感病毒传播与复制间的特殊地位，应密切监测猪流感。

关键词：猪流感病毒 HA基因克隆抗原性分析

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H3N2亚型猪流感病毒的拯救

H3N2亚型猪流感病毒的拯救

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：杜金玲刘明杨涛刘春国李洪涛孙恩成万春和刘大飞陈浩齐金龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江八一农垦大学动物科技学院福建省农科院畜牧兽医研究所

利用反向遗传学操作技术,以A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株为亲本株,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分11段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,转染293T和MDCK共培养细胞,成功拯救出全部基因均来自于A/Swine/Henan/S4/01(H3... 详细信息

利用反向遗传学操作技术,以A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株为亲本株,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分11段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,转染293T和MDCK共培养细胞,成功拯救出全部基因均来自于A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)的猪流感病毒,生物学实验结果表明该拯救毒株在鸡胚半数感染量,组织培养半数感染量,稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。拯救的H3N2亚型猪流感病毒经鸡胚多次传代后血凝价最高可达到1颐256,在接种MDCK60h后,血凝价可达到1颐64。H3N2亚型猪流感病毒的拯救成功,为研究流感病毒突破种间屏障分子机制和猪流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。

关键词：猪流感 H3N2亚型反向遗传病毒拯救

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重组H5N3亚型禽流感细胞毒灭活疫苗免疫佐剂效果的评价

重组H5N3亚型禽流感细胞毒灭活疫苗免疫佐剂效果的评价

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：刘春国刘明刘大飞李洪涛杨涛孙恩成杜金玲中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室东北农业大学动物医学学院黑龙江八一农垦大学动物科技学院

为评价不同佐剂对疫苗免疫效果的影响,本试验以利用反向遗传操作技术拯救的重组H5N3亚型禽流感病毒疫苗株为种毒,对国产矿物油以及赛比克公司提供的MontanideTMISA 70M VG(简称70M)和MontanideTMISA 206 VG(简称206)三种佐剂制备的灭活... 详细信息

为评价不同佐剂对疫苗免疫效果的影响,本试验以利用反向遗传操作技术拯救的重组H5N3亚型禽流感病毒疫苗株为种毒,对国产矿物油以及赛比克公司提供的MontanideTMISA 70M VG(简称70M)和MontanideTMISA 206 VG(简称206)三种佐剂制备的灭活疫苗进行了SPF鸡免疫攻毒试验。结果表明国产矿物油佐剂组与70M佐剂组都能对SPF鸡100%保护,206佐剂组仅能保护40%SPF鸡不死亡;从抗体水平上比较发现70M佐剂组稍好于国产矿物油佐剂组,但两组差异不显著,而两组与206佐剂组差异极显著。该三种佐剂组免疫鸭均能够诱导产生较高的抗体水平,70M佐剂组优于国产矿物油佐剂组和206佐剂组,但三者差异不显著。用70M系的8种佐剂MontanideTMISA 70 essaiMi(i=1-8)(简称70Mi)佐剂乳化的疫苗免疫SPF鸡,结果表明70M佐剂组效果最好,攻毒后免疫鸡不排毒、不发病、不死亡,统计学分析显示70M佐剂组与所有70Mi佐剂组差异均显著。试验结果表明70M佐剂可以作为新型疫苗佐剂用于流感疫苗的制备。

关键词：禽流感 H5N1亚型细胞苗佐剂

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重组细胞高产型H3N2猪流感病毒株的拯救

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病毒学报 2007年第6期23卷 471-476页

作者：杨涛刘明刘春国张云刘大飞陈浩童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001

为拯救出一株能够在动物传代细胞中高水平复制的H3N2亚型猪流感疫苗株,利用反向遗传操作技术,将A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)毒株的PB1、PA、NP、M、NS基因和A/PR/8/34毒株的PB2基因作为内部基因与猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒... 详细信息

为拯救出一株能够在动物传代细胞中高水平复制的H3N2亚型猪流感疫苗株,利用反向遗传操作技术,将A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)毒株的PB1、PA、NP、M、NS基因和A/PR/8/34毒株的PB2基因作为内部基因与猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株的HA、NA基因进行重组,成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株rH3N2株,该毒株接毒MDCK细胞60h后,血凝价可以达到1∶512,表明该毒株具有高度适应细胞繁殖特性,为H3N2亚型猪流感病毒细胞培养型疫苗的研制奠定了基础。

关键词：猪流感 H3N2亚型反向遗传操作技术细胞培养型流感疫苗

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猪源H9N2亚型流感病毒HA基因的序列测定及真核表达

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中国预防兽医学报 2007年第12期29卷 916-919页

作者：韩庆功乔传玲杨焕良陈艳辛晓光丁选亚陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室

利用RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Zhejiang/7/2004(H9N2)(SW/ZhJ7/04)HA基因,测序后将其克隆到真核表达载体pCAGGS上,经酶切分析、PCR鉴定和测序验证,得到重组表达质粒pCAGGS-HA,之后将其转染293T细胞,48h后收集转染细胞样品,进行SDS-PAGE分析,结果显示HA蛋白获得了表达。经Western blot检测,结果表明pCAGGS-HA能够在体外瞬时表达具有免疫学活性的HA蛋白,通过免疫小鼠,对其免疫效果进行了初步研究。

关键词：猪流感病毒 HA基因序列测定真核表达

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H5N1亚型禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达及其生物活性鉴定

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中国生物工程杂志 2007年第3期27卷 42-46页

作者：张晓霁刘明刘春国杨涛张云中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

经RT-PCR扩增了H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)片段,限制性内切酶酶切后将其克隆到pFastBacHTA杆状病毒转座载体,经酶切鉴定及测序,筛选出阳性重组转座载体pFastBac-H5。将pFastBacH5转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受... 详细信息

经RT-PCR扩增了H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)片段,限制性内切酶酶切后将其克隆到pFastBacHTA杆状病毒转座载体,经酶切鉴定及测序,筛选出阳性重组转座载体pFastBac-H5。将pFastBacH5转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-H5。rBacmid-H5在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot、血凝试验和血凝抑制试验分析表明:分子量约63kDa重组血凝素蛋白(rH5)在sf9昆虫细胞中实现了高效表达。rH5具有血凝活性,而且其血凝活性能够被H5N1禽流感病毒高免血清所抑制;rH5免疫鸡诱导产生针对H5N1禽流感病毒亚型特异的血凝抑制抗体,说明表达的重组蛋白具有与天然蛋白相似的生物活性。

关键词：禽流感病毒血凝素基因杆状病毒表达

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重组H5N3禽流感疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖条件研究

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中国预防兽医学报 2007年第3期29卷 199-203页

作者：杨涛刘明张云刘春国王洪峰蔡雪辉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究通过反义遗传学技术构建的重组禽流感病毒rH5N3疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖规律,确定最佳增殖条件,将rH5N3疫苗株分别在500mL和10L转瓶培养的MDCK细胞中进行增殖试验,检测不同接毒量以及接毒后不同时间里的血凝价,以确定病毒的... 详细信息

为研究通过反义遗传学技术构建的重组禽流感病毒rH5N3疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖规律,确定最佳增殖条件,将rH5N3疫苗株分别在500mL和10L转瓶培养的MDCK细胞中进行增殖试验,检测不同接毒量以及接毒后不同时间里的血凝价,以确定病毒的增殖情况。结果表明,在确定的最佳病毒增殖条件下,该重组rH5N3疫苗株在500mL转瓶和10L转瓶中可获得大量增殖,病毒的最高血凝价均可达到1∶1024。rH5N3疫苗株可以在MDCK细胞中大规模增殖,操作方法简便,成本低廉,该方法为禽流感细胞培养型疫苗的大规模生产奠定了基础。

关键词：禽流感细胞培养 MDCK细胞

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