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中国兽医科学 2010年第4期40卷 357-362页

作者：张新涛刘明杜金玲刘春国李洪涛孙恩成石薇琳中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感开放实验室及国家禽流感参考实验室OIE禽流感参考实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

为研究A型禽流感病毒M2蛋白胞外功能区(M2e)蛋白亚单位疫苗在鸡体的免疫保护力,利用笔者所在实验室已构建的含M2e基因的质粒pGEM-T-1459,获得顺次串联的基因片段3M2e,将其克隆到原核表达载体pMAL-C2x中,经酶切和DNA测序鉴定正确后转化... 详细信息

为研究A型禽流感病毒M2蛋白胞外功能区(M2e)蛋白亚单位疫苗在鸡体的免疫保护力,利用笔者所在实验室已构建的含M2e基因的质粒pGEM-T-1459,获得顺次串联的基因片段3M2e,将其克隆到原核表达载体pMAL-C2x中,经酶切和DNA测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示,表达出一分子质量为60 ku的可溶性融合蛋白(MBP-3M2e),与预期值相符,该蛋白表达量约占菌体表达量的59.8%。间接免疫荧光和间接ELISA检测结果显示,用纯化后的融合蛋白免疫的SPF鸡血清可与流感病毒的M2蛋白发生反应,且其抗体效价较高,表明纯化后的重组融合蛋白具有良好的免疫原性。

关键词： A型禽流感病毒 M2e基因原核表达免疫原性

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A型禽流感病毒不同拷贝数基质蛋白胞外区基因的原核表达及免疫保护力研究

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中国预防兽医学报 2010年第10期32卷 795-799页

作者：李洪涛张新涛刘明刘春国杜金玲石薇琳孙恩成中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感开放实验室及国家禽流感参考实验室/OIE禽流感参考实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

为研究含禽流感病毒(AIV)不同拷贝数基质蛋白胞外功能区(M2e)亚单位疫苗在SPF鸡体中的免疫保护效力差异,根据已发表的高致病性AIV M2基因序列设计合成两对引物,利用PCR技术扩增单个M2e基因片段,以此为基础顺次串联得到不同拷贝数的M2e... 详细信息

为研究含禽流感病毒(AIV)不同拷贝数基质蛋白胞外功能区(M2e)亚单位疫苗在SPF鸡体中的免疫保护效力差异,根据已发表的高致病性AIV M2基因序列设计合成两对引物,利用PCR技术扩增单个M2e基因片段,以此为基础顺次串联得到不同拷贝数的M2e基因片段,并将其克隆到pMAL-C2x载体中,构建不同拷贝数的A型AIV M2e基因的重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定。表达产物经纯化后免疫家兔、SPF鸡,制备抗M2e融合蛋白的多克隆抗体。Western blot和间接免疫荧光试验检测纯化的融合蛋白免疫原性,间接ELISA测定鸡血清抗体水平,表明MBP-3M2e融合蛋白的抗体水平较高,且MBP-3M2e亚单位疫苗产生最好的免疫保护力。

关键词： A型禽流感病毒 M2e基因原核表达多克隆抗体免疫保护力

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H5N2亚型禽流感病毒的基因特征及遗传进化分析

H5N2亚型禽流感病毒的基因特征及遗传进化分析

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：段振华张翼施建忠刘丽玲田国彬曾显营张书霞陆承平华育平陈化兰李雁冰南京农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室/国家禽流感参考实验室东北林业大学野生动物资源学院

为了解我国野生水禽携带的H5N2亚型禽流感病毒(AIV)的特征。本研究对2005-2006年江西省和黑龙江省正常野鸭体内分离到的11株H5N2亚型AIV进行全基因测定和遗传演化分析。结果表明:2005年分离自江西省的10株H5N2亚型禽流感病毒的HA基因裂... 详细信息

为了解我国野生水禽携带的H5N2亚型禽流感病毒(AIV)的特征。本研究对2005-2006年江西省和黑龙江省正常野鸭体内分离到的11株H5N2亚型AIV进行全基因测定和遗传演化分析。结果表明:2005年分离自江西省的10株H5N2亚型禽流感病毒的HA基因裂解位点均具有4～6个连续的碱性氨基酸,同属于高致病力毒株;2006年分离自黑龙江省的1株H5N2亚型禽流感病毒的HA基因裂解位点为R-E-T-R,属于典型的H5亚型低致病力毒株。遗传进化上,11株病毒同属于欧亚种系,HA、NA、PB1、PA和NS基因进化关系较近,但分别以不同的毒株为祖先进化而来;PB2、NP和M基因在各自的进化关系上距离较远,核苷酸同源率差异较大。并且11株病毒是以多基因型形式存在。

关键词：禽流感病毒 H5N2 遗传分析

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密码子优化的H5亚型流感病毒HA基因重组质粒在哺乳动物细胞中的高效表达及其免疫原性的研究

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自然科学进展 2009年第8期19卷 813-818页

作者：刘春国刘明孙恩成李洪涛杜金玲张新涛石薇琳谢金鑫刘大飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室及国家禽流感参考实验室哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆163319

为了提高流感病毒血凝素(HA)基因的表达量及其免疫原性,按照哺乳动物偏爱密码子将A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)流感病毒的血凝素基因进行优化改造,然后插入到真核表达载体pCI-neo中,构建了真核表达质粒pCI-opti-HA.将此质粒和含野生HA基因... 详细信息

为了提高流感病毒血凝素(HA)基因的表达量及其免疫原性,按照哺乳动物偏爱密码子将A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)流感病毒的血凝素基因进行优化改造,然后插入到真核表达载体pCI-neo中,构建了真核表达质粒pCI-opti-HA.将此质粒和含野生HA基因的真核表达质粒pCI-wt-HA分别转染Vero或293T细胞,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和蛋白免疫印迹(WB)实验比较HA蛋白的表达量.将两种重组质粒免疫Balb/c小鼠,比较两者诱导的抗体产生水平.三次免疫后两周用强毒攻击,通过体温和体重变化评价两种重组质粒的免疫保护效果.IP-MA和WB实验结果表明:密码子优化后,HA蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平显著提高.酶联免疫吸附实验(ELISA)结果表明:小鼠免疫后密码子优化的重组质粒诱导的特异性抗体效价较高.攻毒试验结果表明:两种重组质粒均能够提供较好的保护.

关键词： H5亚型流感病毒 HA 密码子优化 DNA疫苗免疫效果

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H5N1亚型禽流感变异株灭活疫苗种毒Re-4株的生物学特性及免疫原性研究

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中国预防兽医学报 2009年第9期31卷 717-720页

作者：田国彬曾显营钟功勋姜永萍李雁冰施建忠毛胜刚冯菊艳王君伟陈化兰东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室/国家禽流感参考实验室黑龙江哈尔滨150001 哈尔滨维科生物技术开发公司黑龙江哈尔滨150001

本实验对经反向遗传方法构建的重组禽流感H5N1亚型变异株灭活疫苗种毒Re-4株的生物学特性及免疫效力进行研究。将Re-4株接种SPF鸡胚后37℃培养72h,鸡胚存活,无病变,HA滴度达29;以0.1mL(106.0EID50/0.1mL)的剂量鼻腔感染4周龄SPF鸡7d后血... 详细信息

本实验对经反向遗传方法构建的重组禽流感H5N1亚型变异株灭活疫苗种毒Re-4株的生物学特性及免疫效力进行研究。将Re-4株接种SPF鸡胚后37℃培养72h,鸡胚存活,无病变,HA滴度达29;以0.1mL(106.0EID50/0.1mL)的剂量鼻腔感染4周龄SPF鸡7d后血清HI抗体转阳,无任何症状,也不排毒;SPF鸡静脉致病指数(IVPI)为0;以Re-4重组株为种毒制备灭活疫苗,免疫SPF鸡后,3周后平均HI抗体效价达8.75log2;免疫鸡对亲本强毒株CKSX/06,以及变异株CKNX/06和流行株GSGD/96攻击提供完全保护。以上结果表明变异株灭活疫苗种毒Re-4株对SPF鸡胚和SPF鸡无致病性、适合鸡胚增殖、抗原针对性强,并且以该毒株制备的灭活疫苗具有良好的免疫效力,是研制预防H5N1亚型禽流感病毒山西变异株的理想疫苗种毒株。

关键词：禽流感 H5N1 变异株灭活疫苗

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鸭源H5N1亚型禽流感病毒分离株的致病性及表面蛋白基因序列分析

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畜牧与兽医 2008年第11期40卷 17-20页

作者：杨德全李雁冰施建忠陈化兰张书霞南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室国家禽流感参考实验室黑龙江哈尔滨150001

分析1株2004年从广东省分离获得的HSN1型禽流感病毒株A／Duck／GuangdongJiedong／23／2004对SPF鸡和鸭的致病性，并对其血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因的序列进行测定，与GenBank中收录的其他序列进行比较。结果，此分离株对... 详细信息

分析1株2004年从广东省分离获得的HSN1型禽流感病毒株A／Duck／GuangdongJiedong／23／2004对SPF鸡和鸭的致病性，并对其血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因的序列进行测定，与GenBank中收录的其他序列进行比较。结果，此分离株对SPF鸡和鸭均具有高致病性，且致死率达100％。HA基因与SCK／ST／475／04的同源率最高，而NA基因与Ck／GD／178／04同源率最高。进化分析结果表明，此毒珠与DK／Chi—na／E319-2／03的HA、NA亲缘关系较近，推测它们来源于同一祖代毒株。推导的HA基因氨基酸裂解位点为-RRRKK-，具有典型高致病性禽流感的特征序列；NA基因颈部49～68位20个氨基酸缺失是近年来H5N1亚型优势流行株共同的遗传标志。

关键词：禽流感病毒 1-15N1亚型致病性血凝素神经氨酸酶序列分析

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我国H5N1亚型高致病性禽流感病毒抗原变异株的鉴定分析

我国H5N1亚型高致病性禽流感病毒抗原变异株的鉴定分析

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：李雁冰施建忠赵海丹田国彬王冬宋家升杨德全邓国华王秀荣陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家兽医生物技术重点开放实验室/国家禽流感参考实验室/农业部动物流感重点开放实验室

本文对引起我国2006年山西、宁夏2省(区)H5N1亚型禽流感疫情的代表毒株-A/chicken/Shanxi/2/2006(H5N1)(CK/SX/06)进行了全面研究。结果表明该病毒具有高致病力禽流感病毒(HPAIV)特征,基因组序列分析发现其8个基因片段与我国传统H5N1亚... 详细信息

本文对引起我国2006年山西、宁夏2省(区)H5N1亚型禽流感疫情的代表毒株-A/chicken/Shanxi/2/2006(H5N1)(CK/SX/06)进行了全面研究。结果表明该病毒具有高致病力禽流感病毒(HPAIV)特征,基因组序列分析发现其8个基因片段与我国传统H5N1亚型禽流感病毒GS/GD/1/96(H5N1)存在较大差异,属于新的基因型-山西鸡型;抗原性分析结果表明其在抗原性与GS/GD/1/96同样存在较大变异,遂将其命名为"山西鸡型"抗原变易株;以剂量106EID50/0.1mL将该病毒鼻腔接种4周龄SPF鸭以评价其对水禽的感染能力,结果表明其不感染鸭;常规方法接种BALB/C鼠以评价其对哺乳动物的感染和致病能力,结果表明其能感染鼠,但不引起死亡,呈低致病力。说明该类型高致病性H5N1HPAIV目前仅危害鸡,不具备感染水禽的能力,感染哺乳动物但不致死。但该类型病毒的出现与流行仍然为我国禽流感的免疫与防治提出新的课题。

关键词： H5N1HPAIV CK/SXYQ/2/06 山西鸡型抗原变异

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我国近年H5N1亚型HPAIV的遗传进化

我国近年H5N1亚型HPAIV的遗传进化

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中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会

作者：李雁冰施建忠田国彬曾显营齐巧玲赵海丹杨德全王冬宋家升赵东明邓国华王秀荣陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家兽医生物技术重点开放实验室国家禽流感参考实验室农业部动物流感重点开放实验室

前言:2003年底,东南亚多个国家开始暴发H5N1亚型高致病性禽流感(HPAI),我国自2004年1月26日第一起疫情出现以来,相同疫情在我国时有发生。近年来我国禽流感疫情的特点各不相同,2005年的突出特点是我国青海湖5月暴发了流感史上第一起野鸟... 详细信息

前言:2003年底,东南亚多个国家开始暴发H5N1亚型高致病性禽流感(HPAI),我国自2004年1月26日第一起疫情出现以来,相同疫情在我国时有发生。近年来我国禽流感疫情的特点各不相同,2005年的突出特点是我国青海湖5月暴发了流感史上第一起野鸟H5N1亚型HPAI,该次事件打破了人们认为水鸟是流感病毒的自然宿主,携带病毒而不表现临床症状的传统认识。此后,随着野鸟的迁徙,该病由亚洲逐渐传播到欧洲、非洲等地,目

关键词：基因型 HPAIV

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我国H5N1亚型HPAIV对哺乳动物感染与致病性研究

我国H5N1亚型HPAIV对哺乳动物感染与致病性研究

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第二届全国人畜共患病学术研讨会

作者：李雁冰施建忠田国彬曾显营赵东明杨德全王冬宋家升陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家兽医生物技术重点开放实验室国家禽流感参考实验室农业部动物流感重点开放实验室

2003年底,东南亚多个国家开始暴发H5N1亚型高致病性禽流感(HPAI),H5N1HPAIV在对禽鸟肆虐的同时,也给人类带来了严重危害,同时其它种类哺乳动物也有感染及死亡病例的发生。2008年6月19日,WHO报道全世界已有385人感染,243例死亡,我国自200... 详细信息

2003年底,东南亚多个国家开始暴发H5N1亚型高致病性禽流感(HPAI),H5N1HPAIV在对禽鸟肆虐的同时,也给人类带来了严重危害,同时其它种类哺乳动物也有感染及死亡病例的发生。2008年6月19日,WHO报道全世界已有385人感染,243例死亡,我国自2005年报道人感染禽流感病毒并死亡的事件以来,至今已有30人感染,其中20人不幸医治无效。所以

关键词： HPAIV 哺乳动物

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H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的表达及纯化

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中国兽医科学 2007年第9期37卷 783-786页

作者：黎玉梅邓国华熊蕊冉多良陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室国家禽流感参考实验室黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

用RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Zhejiang/12/00中获得NA基因,将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-32a中,将序列测定和双酶切验证准确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导,经SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显... 详细信息

用RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Zhejiang/12/00中获得NA基因,将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-32a中,将序列测定和双酶切验证准确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导,经SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示,重组蛋白得到了可溶性表达,表达的蛋白质分子质量为33 ku;该蛋白可以与禽流感H5N1亚型阳性血清反应,具有良好的免疫原性;ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性。

关键词：禽流感病毒 NA基因克隆原核表达

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