检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2008年第10期30卷 805-810页

作者：张春明乔传玲陈艳杨焕良辛晓光陈化兰冉多良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

根据猪流感病毒(SIV)M基因的保守序列,设计并合成一对特异性引物和TaqManMGB探针,建立了SIVM基因实时荧光定量PCR检测方法。使用含有M基因的重组质粒pMD-M作为标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999,检测结果表明:该方法的敏感性可达到1... 详细信息

根据猪流感病毒(SIV)M基因的保守序列,设计并合成一对特异性引物和TaqManMGB探针,建立了SIVM基因实时荧光定量PCR检测方法。使用含有M基因的重组质粒pMD-M作为标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999,检测结果表明:该方法的敏感性可达到1个EID50,组间与组内重复试验变异系数分别为0.21%和0.65%,除SIV外,其他5种猪病病毒检测均为阴性,样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均达到100%,该方法特异性强、重复性好,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法。

关键词： SIV Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR

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H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/Duck/Guangxi/53/02株感染性克隆的构建

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中国兽医学报 2008年第5期28卷 536-538,552页

作者：温峰琴樊树芳胡永浩邓国华陈化兰甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室／兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

A/Duck/Guangxi/53/02(DKGX)是从我国南方健康鸭体内分离到的H5N1亚型禽流感病毒,该病毒对鸡具有高致病性,而且能感染哺乳动物模型Balb/c小鼠,但不致死小鼠(MLD50>106.5)。本试验根据GenBank上的序列DKGX/53/02设计了8对引物,建立了... 详细信息

A/Duck/Guangxi/53/02(DKGX)是从我国南方健康鸭体内分离到的H5N1亚型禽流感病毒,该病毒对鸡具有高致病性,而且能感染哺乳动物模型Balb/c小鼠,但不致死小鼠(MLD50>106.5)。本试验根据GenBank上的序列DKGX/53/02设计了8对引物,建立了对DKGX的8质粒反向遗传操作系统,并通过细胞转染技术成功拯救了R-DKGX。R-DKGX在对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野生毒(W-DKGX,MLD50>106.5)一致的生物学特性,即106EID50鼻腔感染小鼠后3 d均只能在肺脏检测到病毒,病毒含量分别为(3.22±0.51)lgEID50/mL和(3.69±0.88)lgEID50/mL,MLD50>106.5。

关键词：禽流感病毒 H5N1 感染性克隆

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H5N1亚型禽流感病毒A／Anhui／2／2005活候选疫苗株的构建及其对鸡致病性的研究

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中国预防兽医学报 2008年第11期30卷 831-835页

作者：樊树芳许传田索永兵陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室／兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018

A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗供体株具有冷适应性、温度敏感性和致弱性表型。本研究利用基因工程技术体外合成A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗株具有冷适应性的内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS,从A/Anhui/2/2005(H5N1)毒株... 详细信息

A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗供体株具有冷适应性、温度敏感性和致弱性表型。本研究利用基因工程技术体外合成A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)冷适应疫苗株具有冷适应性的内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS,从A/Anhui/2/2005(H5N1)毒株获得HA、NA,并对HA基因上的多个连续碱性氨基酸基序进行了缺失修饰。将上述8个基因片段分别克隆至pBD双向表达载体中测序鉴定。利用质粒反向遗传操作系统,将构建正确的8个重组pBD质粒转染Vero细胞拯救病毒。经RT-PCR和序列测定鉴定,结果表明本试验成功获得了一株H5N1亚型A/Anhui/2/2005重组病毒,将其命名为AH/AAca,救获的重组病毒具有预期的温度敏感性和冷适应性生物学特性。随后进行了AH/AAca人工感染SPF鸡的感染性和致病性试验,结果表明其对鸡既无感染性,也无致病性。AH/AAca的获得为评价其在小鼠、非人类灵长目等动物模型上的保护效力的研究打下了坚实基础,为我国预防人禽流感的流行建立了技术储备。

关键词：禽流感病毒反向遗传操作救获病毒冷适应性温度敏感性

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鸭源H5N1亚型禽流感病毒分离株的致病性及表面蛋白基因序列分析

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畜牧与兽医 2008年第11期40卷 17-20页

作者：杨德全李雁冰施建忠陈化兰张书霞南京农业大学动物医学院江苏南京210095 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室国家禽流感参考实验室黑龙江哈尔滨150001

分析1株2004年从广东省分离获得的HSN1型禽流感病毒株A／Duck／GuangdongJiedong／23／2004对SPF鸡和鸭的致病性，并对其血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因的序列进行测定，与GenBank中收录的其他序列进行比较。结果，此分离株对... 详细信息

分析1株2004年从广东省分离获得的HSN1型禽流感病毒株A／Duck／GuangdongJiedong／23／2004对SPF鸡和鸭的致病性，并对其血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因的序列进行测定，与GenBank中收录的其他序列进行比较。结果，此分离株对SPF鸡和鸭均具有高致病性，且致死率达100％。HA基因与SCK／ST／475／04的同源率最高，而NA基因与Ck／GD／178／04同源率最高。进化分析结果表明，此毒珠与DK／Chi—na／E319-2／03的HA、NA亲缘关系较近，推测它们来源于同一祖代毒株。推导的HA基因氨基酸裂解位点为-RRRKK-，具有典型高致病性禽流感的特征序列；NA基因颈部49～68位20个氨基酸缺失是近年来H5N1亚型优势流行株共同的遗传标志。

关键词：禽流感病毒 1-15N1亚型致病性血凝素神经氨酸酶序列分析

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实时荧光定量PCR技术快速定量检测H3N2亚型猪流感病毒

实时荧光定量PCR技术快速定量检测H3N2亚型猪流感病毒

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：陈艳张春明乔传玲杨焕良张飞吴运谱辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室

选取H3N2亚型猪流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)基因保守序列,使用Primer Express2.0软件设计出特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光定量PCR技术来检测猪流感病毒。使用含有选定检测序列的重组质... 详细信息

选取H3N2亚型猪流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)基因保守序列,使用Primer Express2.0软件设计出特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光定量PCR技术来检测猪流感病毒。使用含有选定检测序列的重组质粒pMD-H3、pMD-N2标准品做标准曲线,结果表明该方法的灵敏度为100拷贝/反应,标准曲线的相关系数分别为0.99015(H3)、0.99947(N2),除猪流感病毒H3N2亚型外,猪流感病毒H1N1亚型、H9亚型与其他5种猪病病毒检测均为阴性,样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均为100%,该方法特异性好、重复性佳,为H3N2亚型猪流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法。

关键词：猪流感病毒 TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR

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单链标记与芯片结合鉴别AIV主要亚型的研究

单链标记与芯片结合鉴别AIV主要亚型的研究

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：陶启蒙王秀荣武嘉男石霖李雁冰包红梅陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室

结合单链标记和基因芯片两种技术,构建可同时区分AIV的H5、H7、H9血凝素亚型及N1、N2神经氨酸酶亚型的基因芯片。分别T\A克隆部分禽流感病毒的M基因,H5、H7、H9亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因,并构建重组质粒。以重组质粒为模板,用PCR方... 详细信息

结合单链标记和基因芯片两种技术,构建可同时区分AIV的H5、H7、H9血凝素亚型及N1、N2神经氨酸酶亚型的基因芯片。分别T\A克隆部分禽流感病毒的M基因,H5、H7、H9亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因,并构建重组质粒。以重组质粒为模板,用PCR方法扩增制备探针,纯化后点于氨基修饰的片子上,制备基因芯片;常规方法从待检样品中提取RNA,用Cy3标记下游引物进行RT-PCR,将荧光素引入PCR产物的反义链中;与芯片杂交,检测AIV主要亚型。结果显示检测探针可特异性的与相应的标记样品进行杂交,呈现较强的杂交信号;该方法可以准确鉴别诊断禽流感主要流行亚型,对感染样品和现地样品检测结果与RT-PCR、鸡胚接种有较高一致性,符合率为100%和96%。研究表明该方法可用于同步鉴别部分主要流行的禽流感亚型,是一种有效的新方法。

关键词：单链标记基因芯片禽流感亚型鉴别

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猪流感(H1N1亚型)灭活疫苗的研究

猪流感(H1N1亚型)灭活疫苗的研究

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：杨焕良乔传玲李海燕陈艳辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室

将一株H1N1亚型的猪流感病毒(SIV)接种鸡胚,收获尿囊液,经甲醛灭活,以氢氧化铝为佐剂制成灭活疫苗。疫苗接种4～6周龄猪后,注射疫苗后均无不良反应。疫苗一次免疫后28d用同亚型病毒108.0EID50剂量攻毒,保护率达80%;二次免疫后14d攻毒可... 详细信息

将一株H1N1亚型的猪流感病毒(SIV)接种鸡胚,收获尿囊液,经甲醛灭活,以氢氧化铝为佐剂制成灭活疫苗。疫苗接种4～6周龄猪后,注射疫苗后均无不良反应。疫苗一次免疫后28d用同亚型病毒108.0EID50剂量攻毒,保护率达80%;二次免疫后14d攻毒可完全保护,攻毒对照组的猪均能够从肺脏中分离到病毒。疫苗在4℃～8℃保存6个月,免疫猪后,免疫效力未见下降。

关键词：猪流感 H1N1亚型灭活疫苗免疫

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猪流感病毒HA基因原核表达及其初步应用

猪流感病毒HA基因原核表达及其初步应用

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：陈艳乔传玲丁选亚杨焕良辛晓光韩庆功陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室

利用RT-PCR方法扩增猪流感病毒A/Swine/Henan/11/2005(H1N1)HA基因,克隆于PMD18-T载体进行测序。以PMD18-HA为模板、利用带酶切位点的引物再次扩增HA基因的开放阅读框(ORF),克隆到表达载体pET32a中,经双酶切、测序及PCR鉴定得到阳性重... 详细信息

利用RT-PCR方法扩增猪流感病毒A/Swine/Henan/11/2005(H1N1)HA基因,克隆于PMD18-T载体进行测序。以PMD18-HA为模板、利用带酶切位点的引物再次扩增HA基因的开放阅读框(ORF),克隆到表达载体pET32a中,经双酶切、测序及PCR鉴定得到阳性重组表达质粒pET-HA,将质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,经终浓度为1mM的IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,HA蛋白获得了高效表达,经Westernblot检测证实表达产物具有良好的免疫学活性,经间接ELISA预试验表明具有良好的抗原反应性。本研究为以重组HA蛋白为抗原建立H1亚型猪流感抗体的ELISA检测方法奠定了基础。

关键词：猪流感病毒 HA基因原核表达

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以GPT和GFP为双重筛选标记的禽痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

以GPT和GFP为双重筛选标记的禽痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：王艳丽李俊辉姜永萍夏俊裴磊冉多良陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室新疆农业大学动物医学院

禽痘病毒作为活载体已经得到广泛的应用,转移栽体的构建是重组禽痘病毒构建的重要环节。本研究构建了禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt,该载体含有gfp和gpt两个报告基因及背对的痘苗病毒晚期启动子P11和早期启动子P7.5,P11启动gfp和... 详细信息

禽痘病毒作为活载体已经得到广泛的应用,转移栽体的构建是重组禽痘病毒构建的重要环节。本研究构建了禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt,该载体含有gfp和gpt两个报告基因及背对的痘苗病毒晚期启动子P11和早期启动子P7.5,P11启动gfp和gpt两个基因,P7.5用于启动外源基因,在早期启动子P7.5下游引入NotⅠ和AflⅡ两个酶切位点,用于外源基因的插入。为检测禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt的效果,将H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/10/01(H9N2)的HA基因插入到此载体构建了转移载体pSY681-gfp-gpt-HA,应用TransIT-LT1 Transfection Reagent将此转移载体转染已感染禽痘病毒S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞,利用gfp和gpt同时进行双重筛选、数轮蚀斑纯化构建了重组病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,通过PCR、Western blot鉴定,结果证明,获得了能稳定表达AIV HA蛋白的重组禽痘病毒r-FPV-gpt-gfp-HA9。

关键词：重组禽痘病毒绿色荧光蛋白黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶 HA基因

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猪流感病毒神经氨酸酶基因(N1和N2)在昆虫细胞中的表达

猪流感病毒神经氨酸酶基因(N1和N2)在昆虫细胞中的表达

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：万春和刘明刘春国杨涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室福建省农业科学院畜牧兽医研究所

根据GenBank发表的N1和N2亚型猪流感NA基因序列设计引物,扩增出NA基因片段,将其克隆到pFastBacGP67A和pFastBacGP67C杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67A-N1和pFastBacGP67C-N2,转化含有杆状病毒穿梭载体(Bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体获得重组转座子rBacmid-N1和rBacmid-N2,在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBv-N1和rBv-N2,再感染细胞,收获目的蛋白。通过SDS-PAGE蛋白电泳、免疫印迹法、免疫组化分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物学活性。

关键词：猪流感病毒神经氨酸酶基因昆虫细胞杆状病毒表达

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