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农业生物技术学报 2016年第7期24卷 980-986页

作者：崔鹏飞卢昆鹏陈思肖丽关立峥邓国华陈化兰甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室

H3N8亚型流感病毒宿主范围广泛,除了可以感染野鸟和家禽外,还可以感染多种哺乳动物,并且H3N8亚型流感病毒跨物种传播的现象也时有发生,对养殖业和人类生命健康都具有重要威胁。为了解H3N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的... 详细信息

H3N8亚型流感病毒宿主范围广泛,除了可以感染野鸟和家禽外,还可以感染多种哺乳动物,并且H3N8亚型流感病毒跨物种传播的现象也时有发生,对养殖业和人类生命健康都具有重要威胁。为了解H3N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的生物学特性,本研究对2013年贵州省分离的两株H3N8亚型AIV(A/duck/Guizhou/S1092/2013(H3N8)(简称DK/GZ/S1092/2013)和A/duck/Guizhou/S1145/2013(H3N8)(简称DK/GZ/S1145/2013))进行了遗传演化分析、小鼠(Mus musculus)感染性实验和受体结合特异性实验。遗传演化分析结果表明,这两株病毒具有明显的遗传多样性,除了血凝素(hemagglutinin,HA)基因位于同一个进化分支外,其他7个基因片段均具有不同起源。感染性实验结果表明,这两株病毒不需要提前适应就可以在小鼠的肺脏和鼻甲内有效复制,对小鼠呈现低致病性,小鼠感染病毒后未出现明显临床症状,且DK/GZ/S1092/2013仅引起小鼠的体重下降1.8%,DK/GZ/S1145/2013仅引起小鼠的体重下降0.8%。受体结合特异性分析结果表明,这两株病毒同时具有结合禽源唾液酸(sialic acid,SA)α2,3-Gal受体和人源SAα2,6-Gal受体的能力,具有感染人类的潜在风险。本研究通过对两株H3N8亚型AIV的生物学特性进行系统分析,发现H3N8亚型AIV具有感染哺乳动物的潜在风险。研究结果对于H3N8亚型AIV的综合防控具有重要的指导意义。

关键词：禽流感病毒(AIV) H3N8 生物学特性

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人源肺细胞cDNA文库构建及与流感病毒NP互作宿主蛋白的筛选

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中国农业科学 2016年第22期49卷 4451-4459页

作者：罗维玉朱鹏阳张杰胡永浩孔晖晖梁立滨周圆李呈军姜丽陈化兰甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室

【目的】构建肺组织细胞Calu-3及A549的高质量酵母cDNA文库并筛选与流感病毒NP蛋白相互作用的宿主因子,为深入研究流感病毒NP蛋白功能、病毒复制及致病机制奠定基础。【方法】提取等量Calu-3及A549细胞的总RNA,混合后反转录生成cDNA,利... 详细信息

【目的】构建肺组织细胞Calu-3及A549的高质量酵母cDNA文库并筛选与流感病毒NP蛋白相互作用的宿主因子,为深入研究流感病毒NP蛋白功能、病毒复制及致病机制奠定基础。【方法】提取等量Calu-3及A549细胞的总RNA,混合后反转录生成cDNA,利用长距离PCR(LD-PCR)扩增合成dscDNA,用CHROMA SPINTM+TE-400纯化柱纯化dsDNA,按照Clontech公司的Make Your Own"Mate&Plate"Library System操作程序,将带有同源臂的dscDNA与线性化p GADT7-Rec共同转化Y187酵母感受态细胞,涂布SD/-Leu平板后于30℃培养4d左右,收集所有菌落,混匀分装即为Calu-3和A549细胞cDNA的酵母文库,并对文库库容、滴度及多样性进行分析。利用Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切将A/Auhui/2/2005(H5N1)NP定向插入pGBKT7载体,构建高致病性流感病毒NP的诱饵质粒p GBKT7-NP,经验证该质粒无自激活活性,并进一步采用构建完成的Calu-3/A549细胞酵母文库进行杂交筛选,筛选得到的正确阅读的猎物质粒与诱饵质粒共转Y2H Gold酵母菌,分别以BD-P53/AD-T7作为阳性对照和BD-Lam/AD-T7作为阴性对照,挑取最终在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal/Aro A(SD/-4/X/A)固体培养板上生长良好且变蓝的菌落,即为候选与目标蛋白互作阳性的蛋白,提取酵母质粒,进行测序分析、序列比对和Gene Ontology分析。【结果】提取两种细胞RNA 28S与18S条带清晰,5S条带暗淡,表明所提RNA质量较高,基本无降解;对提取的RNA反转录纯化获得dscDNA,dscDNA条带呈弥散状,片段大小分布于500—2 000bp之间,说明不同丰度及大小的RNA均成功反转录;构建的dscDNA文库库容为1.5×10~7,滴度为2.2×10~8cfu/m L,重组率为88%,PCR鉴定文库插入片段,条带大小不一、多样性好;利用诱饵质粒与文库进行双杂交筛选,回交验证后得到11个与NP蛋白互作的宿主因子。经Gene Ontology分析显示,11个宿主因子参与的生物过程包括:细胞凋亡、胚胎发育、可变剪接、转录调节及细胞增殖等;涉及的分子功能包括:GTP结合活性、金属离子结合活性、DNA结合活性及转录因子活性。【结论】成功构建同时含有Calu-3和A549两种人源肺细胞cDNA的酵母文库,文库覆盖cDNA更全面,为后期筛选与流感病毒其它蛋白互作的宿主蛋白奠定基础,筛选得到与NP蛋白存在相互作用的宿主因子为进一步深入研究NP功能提供了可靠的前期数据。

关键词：流感病毒 NP蛋白 cDNA文库构建酵母双杂交系统宿主因子

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四株鸭源H3N8亚型禽流感病毒对SPF鸡的感染性分析

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畜牧兽医学报 2016年第6期47卷 1209-1214页

作者：崔鹏飞彭志张芳关立峥肖丽李莉莎邓国华陈化兰甘肃农业大学动物医学院兰州730070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

为评价鸭源H3N8亚型禽流感病毒对鸡的感染风险,作者选取了4株HA基因位于不同进化分支的病毒进行了SPF鸡的感染性试验。结果表明,这4株H3N8亚型禽流感病毒不需要提前适应就可以感染鸡,病毒对鸡不同脏器的组织嗜性存在较大差异。鸡感染病... 详细信息

为评价鸭源H3N8亚型禽流感病毒对鸡的感染风险,作者选取了4株HA基因位于不同进化分支的病毒进行了SPF鸡的感染性试验。结果表明,这4株H3N8亚型禽流感病毒不需要提前适应就可以感染鸡,病毒对鸡不同脏器的组织嗜性存在较大差异。鸡感染病毒后未表现出明显的临床症状,大部分感染鸡可以通过呼吸道和消化道向外排毒。此外,DK/ZJ/S4088/2013和DK/GZ/S1245/2013这两株病毒还可以由感染组的鸡传播给接触组的鸡。综上所述,本研究中的4株鸭源H3N8亚型禽流感病毒具有感染鸡并在鸡群间传播的潜在风险,在家禽的饲养和流通环节中应尽量避免鸡群与鸭群的接触。

关键词：禽流感病毒 H3N8 鸡感染性

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类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及特性分析

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中国兽医科学 2016年第4期46卷 491-495页

作者：杨大为隋金钰吴运谱许榜丰杨焕良陈艳乔传玲陈化兰东北农业大学黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为获得类禽型H1N1猪流感病毒（SIV）血凝素（HA）蛋白的单克隆抗体（McAb）,选取病毒A/swine/Zhejiang/245/2013（H1N1）,经增殖、纯化后作为免疫原,3次免疫BALB/c小鼠,取其脾与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合,利用ELISA方法进行筛选,克... 详细信息

为获得类禽型H1N1猪流感病毒（SIV）血凝素（HA）蛋白的单克隆抗体（McAb）,选取病毒A/swine/Zhejiang/245/2013（H1N1）,经增殖、纯化后作为免疫原,3次免疫BALB/c小鼠,取其脾与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合,利用ELISA方法进行筛选,克隆得到4株杂交瘤细胞株,分别命名为5H7、2H3、2G4、8D7。4株单克隆抗体的腹水ELISA效价为1×10^9以上,HI效价高于8 log2。Western-blot试验与间接免疫荧光试验结果表明,4株McAbs均可与病毒HA蛋白发生特异性的反应。本研究将为进一步建立H1亚型SIV的相关检测方法及开展HA蛋白表位的研究奠定基础。

关键词：猪流感病毒单克隆抗体类禽型H1N1

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湖南洞庭湖区12株H9N2亚型AIV全基因序列的进化分析

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2016年第3期44卷 1-10页

作者：黄建龙谭丹王昌建张朝阳何世成朱春霞汪洪冰邓国华刘道新湖南省动物疫病预防控制中心湖南长沙410014 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

【目的】从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒在湖南省洞庭湖区的变异特点和进化规律。【方法】对近年来洞庭湖区分离的12株H9N2亚型禽流感毒株的全基因进行分段克隆测序,应用Mega 5软件包对病毒基因进行多序列比对和进化树的绘制... 详细信息

【目的】从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒在湖南省洞庭湖区的变异特点和进化规律。【方法】对近年来洞庭湖区分离的12株H9N2亚型禽流感毒株的全基因进行分段克隆测序,应用Mega 5软件包对病毒基因进行多序列比对和进化树的绘制与分析。【结果】12株H9N2亚型禽流感毒株HA裂解位点均没有多个连续的碱性氨基酸插入,属于低致病性病毒。12株H9N2亚型禽流感病毒HA、NA基因进化比较同步,均处于DK/HK/Y280/97分支,而6个内部基因(M、PB2、PB1、PA、NA、NS)与高致病性禽流感H5亚型毒株呈现不同程度重组现象,且与H7N9亚型毒株基因的核苷酸同源性很高,很有可能为其提供内部基因。【结论】湖南省洞庭湖地区H9亚型禽流感病毒的遗传演化较为复杂,存在广泛的基因重组现象。

关键词： H9N2亚型禽流感遗传进化洞庭湖区湖南省

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表达H5亚型禽流感病毒不同形式HA基因重组鸭瘟病毒的构建及HA表达形式的鉴定

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中国预防兽医学报 2016年第4期38卷 266-270页

作者：刘璐丁蕾蕾柳金雄陈普成李爱心胡玉珍姜永萍陈化兰孙晓林甘肃农业大学动物医学学院甘肃兰州730070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的信号肽以及跨膜区对HA蛋白在重组病毒中表达的影响,本研究以鸭瘟病毒(DEV)为载体,在DEV基因组的US7和US8基因之间通过同源重组插入去除信号肽或跨膜区的H5N1亚型AIV HA基因编码序列,分别构建了缺... 详细信息

为研究禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的信号肽以及跨膜区对HA蛋白在重组病毒中表达的影响,本研究以鸭瘟病毒(DEV)为载体,在DEV基因组的US7和US8基因之间通过同源重组插入去除信号肽或跨膜区的H5N1亚型AIV HA基因编码序列,分别构建了缺失信号肽HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PK)和缺失跨膜区HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PSM),并传至20代,经PCR对插入的外源基因编码序列扩增及序列测定,表明外源基因能够在重组病毒基因组中稳定存在;间接免疫荧光和western blot鉴定结果表明去除信号肽的HA蛋白能够在重组病毒感染的鸡胚成纤维细胞浆中正确表达,而去除跨膜区的HA蛋白能够在感染细胞的培养液中检测到。本研究为表达H5N1亚型AIV HA基因重组DEV载体弱毒疫苗在鸭体内免疫机制的进一步研究奠定基础。

关键词：禽流感病毒 HA蛋白重组鸭瘟病毒信号肽跨膜区

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流感病毒NP蛋白与宿主蛋白CAP1相互作用的研究

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中国预防兽医学报 2016年第7期38卷 513-517页

作者：姜水涛赵玉辉周圆罗维玉张杰李呈军陈化兰姜丽中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

流感病毒核衣壳蛋白(NP)是病毒核糖核蛋白复合体(v RNP)的主要组成部分,主要调控病毒基因组的转录和复制。为筛选与流感病毒NP相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交技术(Y2H)在A549细胞c DNA文库中筛选到与其相互作用的宿主蛋白Aden... 详细信息

流感病毒核衣壳蛋白(NP)是病毒核糖核蛋白复合体(v RNP)的主要组成部分,主要调控病毒基因组的转录和复制。为筛选与流感病毒NP相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交技术(Y2H)在A549细胞c DNA文库中筛选到与其相互作用的宿主蛋白Adenylate cyclase-associated protein 1(CAP1),并通过酵母回交验证、免疫共沉淀技术(Co-IP)和GST pull down试验进一步证实NP与CAP1之间存在特异性的直接相互作用。此外,利用激光共聚焦试验证实NP与CAP1共定位于A549细胞的细胞质内。在HEK293T细胞中过表达CAP1蛋白后,流感病毒的复制能力下降,表明CAP1对流感病毒复制具有抑制作用。本研究对该蛋白的鉴定为流感病毒的复制机理研究奠定了基础。

关键词：酵母双杂交 NP蛋白 CAP1蛋白相互作用

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两株EA H1N1亚型猪流感病毒在豚鼠体内的复制和传播能力评估

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中国预防兽医学报 2016年第3期38卷 190-193页

作者：陶世宇王增陈艳杨焕良孔晖晖陈化兰胡永浩甘肃农业大学动物医学学院甘肃兰州730070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为评价欧亚类禽H1N1(EA H1N1)亚型猪流感病毒(SIV)在哺乳动物间呼吸道飞沫的传播能力,本研究选取A/swine/Henan/11/2005(H1N1)(He N11)和A/swine/Hunan/26/2010(H1N1)(HuN26)为代表病毒株,以106EID50/300μL的剂量,经鼻腔分别感染3只豚鼠,24 h后在相邻笼内分别放入3只豚鼠作为传播组,通过检测鼻洗液内的病毒滴度评价2株病毒在豚鼠间呼吸道飞沫的传播能力;并以相同剂量分别感染2只豚鼠,感染72 h后通过检测脏器内病毒滴度评价2株病毒在豚鼠体内的复制能力。传播试验结果表明,HeN11株在豚鼠间的传播能力为3传1,HuN26株为3传3。脏器中病毒滴定结果表明,HeN11株在下呼吸道具有良好的复制能力,而HuN26株主要在上呼吸道复制。进一步的氨基酸差异分析表明,2株病毒株共有62个氨基酸差异。以上结果表明,2株病毒株均能够在豚鼠呼吸道内进行不同程度的复制,而呼吸道飞沫传播能力显著不同。本实验为进一步研究EA H1N1 SIV在哺乳动物间呼吸道飞沫传播的分子机制奠定基础,也为猪流感的防控提供了实验依据。

关键词： EA H1N1 猪流感病毒豚鼠复制传播

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Clade7．2H5N1亚型禽流感重组病毒疫苗株的构建及免疫效力评价

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中国预防兽医学报 2016年第7期38卷 580-584页

作者：宋洋铭谷春阳曾显营邓国华杨孝朴陈化兰甘肃农业大学动物医学学院甘肃兰州730070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

致病性禽流感病毒(AIV)编码HA抗原基因的不断进化,进而出现抗原性变异是导致原有疫苗无法提供完全免疫保护的主要原因,因此需要构建并更新疫苗株。本研究在系统分析AIV病毒抗原性基础上,采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(PR8... 详细信息

致病性禽流感病毒(AIV)编码HA抗原基因的不断进化,进而出现抗原性变异是导致原有疫苗无法提供完全免疫保护的主要原因,因此需要构建并更新疫苗株。本研究在系统分析AIV病毒抗原性基础上,采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以clade7.2 H5亚型A/chicken/He Bei BD/SC007/2012(CK/BD/2012)的c DNA为模板经SOE-PCR扩增,将高致病性AIV的HA基因编码裂解位点序列336PQIEGRRRKR348突变为低致病性特征的336PQRETR343序列,以A/chicken/Shanxi/2/2006(CK/SX/2/2006)作为NA基因的供体,构建clade7.2 AIV疫苗候选株r PR8-BD/2012,并对其进行生物学特性和免疫原性评估。结果显示,该疫苗候选株对鸡胚无致病性,能够在鸡胚中高滴度生长(9 log2),静脉内接种致病指数(IVPI)为0,对雏鸡无致病性。将r PR8-CK/BD/2012作为种毒,按照常规方法制备灭活疫苗,免疫4周龄SPF雏鸡,免疫3周后对亲本强毒株的HI平均抗体效价达7.2 log2;采用亲本强毒A/chicken/He Bei BD/SC007/2012和同分支异源强毒株A/chicken/He Bei/SD001/2013以105 EID50剂量攻击,免疫组均能够得到完全保护。以上结果表明r PR8-CK/BD/2012疫苗候选株具有鸡胚适应性、生物安全性和良好的免疫原性,可以作为有效防控clade7.2 H5N1 AIV的疫苗株。

关键词： H5N1 禽流感病毒反向遗传操作系统疫苗株免疫效力评价

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蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

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甘肃农业大学学报 2016年第1期51卷 7-12页

作者：张涛罗维玉姜水涛朱鹏阳李呈军陈化兰孙晓林姜丽甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21... 详细信息

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.

关键词： PKR 原核表达蛋白纯化多克隆抗体

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