检索结果-内蒙古大学图书馆

实验动物科学 2017年第1期34卷 66-70页

作者：林欢韩凌霞赵丽丽陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物与比较医学团队/国家禽类实验动物种子中心/农业部实验动物质量监督检验测试中心哈尔滨150001

SPF鸡及鸡胚被大量用于人和兽用生物制品的生产基质和质量检定材料,在农业科学、医学科学和生物制品等领域的研究、生产、检定工作中有非常重要的作用。本文总结了SPF鸡及鸡胚的微生物质量控制标准、质量监测技术,以及我国SPF鸡培育和... 详细信息

SPF鸡及鸡胚被大量用于人和兽用生物制品的生产基质和质量检定材料,在农业科学、医学科学和生物制品等领域的研究、生产、检定工作中有非常重要的作用。本文总结了SPF鸡及鸡胚的微生物质量控制标准、质量监测技术,以及我国SPF鸡培育和产业发展概况。

关键词： SPF鸡微生物质量标准监测技术

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昆虫细胞表达兔出血症VP60蛋白间接ELISA方法建立及评价

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东北农业大学学报 2010年第8期41卷 81-88页

作者：刘怀然曲连东刘家森单安山东北农业大学动物科学技术学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、农业部实验动物质量监督检验测试中心哈尔滨150001

采用Bac-to-Bac系统表达的兔出血症病毒（RHDV）结构蛋白VP60作为包被抗原,建立抗体检测间接ELISA方法,并对方法性能进行测定。试验以整合有VP60基因的重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞,感染细胞经裂解、离心初步纯化,作为包被抗原建立了检... 详细信息

采用Bac-to-Bac系统表达的兔出血症病毒（RHDV）结构蛋白VP60作为包被抗原,建立抗体检测间接ELISA方法,并对方法性能进行测定。试验以整合有VP60基因的重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞,感染细胞经裂解、离心初步纯化,作为包被抗原建立了检测RHD抗体的间接ELISA方法。经过对反应条件和试剂的优化选择,初步组装成间接ELISA试剂盒,并对其整体性能进行了评价。结果表明,含重组VP60蛋白的Sf9细胞裂解液最适包被稀释度为1：2000,换算为纯化VP60蛋白含量约为1.7μg·mL^-1;待检血清最适稀释度为1：100;羊抗兔IgGHRP标记抗体最适使用浓度为1：30000。初步组装的ELISA试剂盒检测RHD阴性血清无假阳性反应,与其他常见兔病阳性血清无交叉反应,特异性良好;敏感性高于RHDV全病毒间接ELISA和血凝抑制试验,低于进口间接ELISA试剂盒;试剂盒批内和批间变异率在10%以内。37℃加速破坏试验和4℃保存期试验结果表明试剂盒保存期可以稳定在6个月。该方法可应用于兔出血症抗体水平监测及实验兔等级检测中。

关键词：兔出血症病毒 VP60基因昆虫细胞间接ELISA

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兔出血症病毒单克隆抗体的制备及鉴定

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中国兽医科学 2009年第2期39卷 145-149页

作者：刘怀然秦海斌刘家森单安山曲连东东北农业大学动物科学技术学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部实验动物质量监督检验测试中心黑龙江哈尔滨150001 西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100

为建立兔出血症病毒（RHDV）的检测方法及为变异株监测做储备，用蔗糖密度梯度离心法纯化的RHDV免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞与SP2／0细胞进行融合，以昆虫细胞一杆状病毒表达的重组VP60蛋白建立的间接ELISA法筛选抗RHDV单克隆抗体杂交... 详细信息

为建立兔出血症病毒（RHDV）的检测方法及为变异株监测做储备，用蔗糖密度梯度离心法纯化的RHDV免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞与SP2／0细胞进行融合，以昆虫细胞一杆状病毒表达的重组VP60蛋白建立的间接ELISA法筛选抗RHDV单克隆抗体杂交瘤细胞，并对其主要生物学特性进行了鉴定。结果表明，筛选出6株单抗，它们分属于IgG1（AD4，AG10，DE2）、IgG2b（BC9，BE8）和IgM（BH3）亚类；这6株单抗杂交瘤细胞的平均染色体数为87～89条，将其冻存6个月后复苏，在体外传20代的过程中分泌的抗体效价变化不大，具有很好的稳定性；Western-blot及免疫荧光分析表明，单抗DE2、AG10识别线性表位，其余4株单抗识别构象型表位；竞争ELISA试验表明，这6株单抗可识别5种抗原表位。

关键词：兔出血症病毒单克隆抗体抗原识别位点

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EIAV基因转移载体转录后调控元件的优化

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2008年第2期36卷 1-6页

作者：李亚明韩凌霞曲连东司昌德秦海斌杨增岐于海波徐佳西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心农业部实验动物质量监督检验测试中心黑龙江哈尔滨150001

【目的】为了提高马传染性贫血病毒(EIAV)基因转移载体质粒pcPPTPRE(+)的外源蛋白表达能力,对其转录后调控元件进行优化。【方法】将PCR扩增土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus,WHV)转录后调控元件(WPRE),克隆于pGM-T载体获得重... 详细信息

【目的】为了提高马传染性贫血病毒(EIAV)基因转移载体质粒pcPPTPRE(+)的外源蛋白表达能力,对其转录后调控元件进行优化。【方法】将PCR扩增土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus,WHV)转录后调控元件(WPRE),克隆于pGM-T载体获得重组质粒pGM-WPRE,利用NotⅠ酶将WPRE亚克隆入pcPPTPRE(+),筛选WPRE正向连接的重组质粒pcPPTWPRE,采用磷酸钙法分别将pcPPTWPRE和pcPPTPRE(+)转染HEK293细胞和DF-1细胞,利用荧光显微镜观察EGFP蛋白的表达,利用流式细胞仪检测转染细胞中EGFP阳性细胞的表达率。【结果】在HEK293细胞中,pcPPTWPRE表达外源基因的能力极显著优于pcPPTPRE(+);在DF-1细胞中,pcPPTWPRE与pcPPTPRE(+)表达外源基因的能力均不强,但前者略优于后者。【结论】土拨鼠肝炎病毒转录后,调控元件(WPRE)可以明显增强EIAV载体质粒的外源蛋白表达能力,为高表达能力伪型EIAV重组病毒的获得奠定了基础,同时也为其他病毒载体的构建提供了借鉴。

关键词：马传染性贫血病毒土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件基因转移载体增强绿色荧光蛋白

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兔出血症病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立

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中国兽医学报 2008年第1期28卷 28-31,44页

作者：秦海斌刘怀然曲连东刘家森韩凌霞姜骞李亚明杨增岐西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部实验动物质量监督检验测试中心黑龙江哈尔滨150001

用兔出血症病毒(RHDV)单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,建立RHDV抗原捕获ELISA检测方法,优化反应条件并对该方法的敏感性、特异性、重复性、稳定性等指标进行了测试和评价。结果表明,单抗最佳包被质量浓度为1mg/L,兔... 详细信息

用兔出血症病毒(RHDV)单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,建立RHDV抗原捕获ELISA检测方法,优化反应条件并对该方法的敏感性、特异性、重复性、稳定性等指标进行了测试和评价。结果表明,单抗最佳包被质量浓度为1mg/L,兔多抗血清最佳质量浓度为4mg/L。本方法可特异性地检测出兔肝脏病料中的RHDV,纯化病毒的最低检出量为26μg/L。对已知阳性样品的检测显示,捕获ELISA检测的病毒滴度是HA试验的3～13倍。对67份可疑病料,捕获ELISA阳性检出率为62.7%,HA试验阳性检出率为55.2%。用不同批次包被的酶标板重复检测已知样品显示出良好的重复性。本方法敏感性、特异性、稳定性良好,可应用于RHDV的快速、批量、特异检测。

关键词：抗原捕获:ELISA 单克隆抗体兔出血症

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miRNA表达载体的构建与抑制禽流感病毒(AIV)复制的研究

miRNA表达载体的构建与抑制禽流感病毒(AIV)复制的研究

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：孟庆文刘丹秦红刚李文超曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部实验动物质量监督检验测试中心新疆农业大学动物医学学院

miRNA是一类内源性的长约21nt～25nt的短序列非编码单链RNA,可以通过部分互补或者完全互补结合到目的靶mRNA,以诱发蛋白质翻译抑制(翻译抑制子)或者介导目的mRNA的降解调节基因表达。根据这一特性,设计靶向禽流感病毒的miRNA编码序列,... 详细信息

miRNA是一类内源性的长约21nt～25nt的短序列非编码单链RNA,可以通过部分互补或者完全互补结合到目的靶mRNA,以诱发蛋白质翻译抑制(翻译抑制子)或者介导目的mRNA的降解调节基因表达。根据这一特性,设计靶向禽流感病毒的miRNA编码序列,使之与靶mRNA完全互补。将其克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体中,构建单个或多个串联miRNA表达载体,分别为pcDNA6.2/NP、pcDNA6.2/PA、pcDNA6.2/PB2、pcDNA6.2/PA+NP和pcDNA6.2/PA+NP+PB2。鉴定正确后,将重组质粒转染MDCK细胞,禽流感病毒A/Goose/Guangdong1/96(H5N1)感染细胞。荧光显微镜判断转染效率,血凝(HA)试验和Real-timeRT-PCR检测抑制效果。荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达60%;试验血凝(HA)试验结果表明,重组质粒均能抑制流感病毒的复制,以pcDNA6.2/PA+NP+PB2的抑制效果最佳,它们抑制流感病毒增殖的能力分别62.5%、50%、62.5%和75%、81%;Real-timeRT-PCR结果表明,多个miRNA串联起来比单个miRNA有较高的抑制流感病毒复制的效果。

关键词： miRNA 串联表达病毒抑制 AIV

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抗犬瘟热病毒重组核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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中国预防兽医学报 2007年第7期29卷 528-532页

作者：周洁姜骞张洪英刘家森刘立奎陈洪岩韩凌霞司昌德曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部实验动物质量监督检验测试中心黑龙江哈尔滨150001

以纯化的重组犬瘟热病毒（CDV）N蛋白免疫BALB/c小鼠,应用常规杂交瘤技术获得两株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为A4C6C12和A5B8H7间接ELISA检测腹水效价分别为1：106、1：105;亚类鉴定结果分别为IgG2a、IgG2b,轻... 详细信息

以纯化的重组犬瘟热病毒（CDV）N蛋白免疫BALB/c小鼠,应用常规杂交瘤技术获得两株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为A4C6C12和A5B8H7间接ELISA检测腹水效价分别为1：106、1：105;亚类鉴定结果分别为IgG2a、IgG2b,轻链均为K型;Western blot和ELISA分析结果显示2株单克隆抗体均能与重组N蛋白和CDV发生反应,而与犬细小病毒及犬腺病毒等无交叉反应;ELISA叠加试验的增值结果表明两株单克隆抗体识别的抗原位点不同.特异性抗CDV-rN的单克隆抗体的获得,为进一步用于临床诊断研究奠定了基础.

关键词：犬瘟热病毒重组核衣壳蛋白单克隆抗体

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兔出血症病毒抗原捕获ELISA检测方法

兔出血症病毒抗原捕获ELISA检测方法

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第五届中国北方实验动物科技年会

作者：秦海斌刘怀然刘家森姜骞韩凌霞司昌德曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部实验动物质量监督检验测试中心哈尔滨150001 西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部实验动物质量监督检验测试中心哈尔滨150001

用RHDV单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,建立兔瘟病毒 (RHDV) 抗原捕获ELISA检测方法,优化反应条件并对该方法的敏感性、特异性、重复性、稳定性等指标进行了测试和评价. 结果表明,单抗最佳包被浓度为1 μg/mL,兔... 详细信息

用RHDV单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,建立兔瘟病毒 (RHDV) 抗原捕获ELISA检测方法,优化反应条件并对该方法的敏感性、特异性、重复性、稳定性等指标进行了测试和评价. 结果表明,单抗最佳包被浓度为1 μg/mL,兔多抗血清最佳浓度为4 μg/mL,本方法可特异性地检测出兔肝脏病料中的RHDV,纯化病毒的最低检出量为26 ng/mL,对已知阳性样品的检测显示,捕获ELISA检测的病毒滴度是HA实验的3～13倍,对67份可疑病料,捕获ELISA阳性检出率为62.7％,HA实验阳性检出率为55.2％,用不同批次包被的酶标板重复检测已知样品显示出良好的重复性. 本方法敏感性、特异性、稳定性良好,可应用于RHDV的快速、批量、特异检测.

关键词：兔出血症病毒抗原捕获 ELISA检测单克隆抗体兔瘟病毒

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兔出血症病毒VP60基因在昆虫细胞中形成病毒样颗粒及其特性

兔出血症病毒VP60基因在昆虫细胞中形成病毒样颗粒及其特性

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第五届中国北方实验动物科技年会

作者：刘怀然刘家森胡迎东陈洪岩单安山曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部实验动物质量监督检验测试中心哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部实验动物质量监督检验测试中心哈尔滨150001 沈阳农业大学畜牧兽医学院沈阳110161 东北农业大学动物科技学院哈尔滨150030

目的：将兔出血症病毒(RHDV)VP60全长基因在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,验证重组蛋白形成病毒样颗粒(VLPs)的能力及其生物学特性,探讨VLPs作为检测抗原及亚单位疫苗的潜力. 方法：用Bac-to-Bac系统体外表达RHDV VP60全长基因.以... 详细信息

目的：将兔出血症病毒(RHDV)VP60全长基因在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,验证重组蛋白形成病毒样颗粒(VLPs)的能力及其生物学特性,探讨VLPs作为检测抗原及亚单位疫苗的潜力. 方法：用Bac-to-Bac系统体外表达RHDV VP60全长基因.以免疫荧光及Western blotting检测蛋白表达情况及确定蛋白最佳表达条件;免疫电镜观察VLPs形态,并对VLPs的血凝性、免疫原性进行检测. 结果： SDS-PAGE电泳分析表明,表达的重组蛋白分子量大小约为68 KDa,在免疫荧光、琼脂扩散、ELISA试验中均与RHD多克隆抗血清特异性反应;接种重组病毒的Sf9细胞裂解液在电镜下可观察到与RHDV形态相似的VLPs;该VLPs可凝集人"O"、"B"型红细胞,凝集可被RHD多克隆抗血清所抑制;含VLPs的Sf9细胞裂解液可不经纯化用作间接ELISA抗原,所建立的ELISA方法与进口商品化试剂盒相比,特异性良好,敏感性、检出率稍低;将含VLPs的细胞裂解液加氟氏佐剂免疫兔,HI效价可达1∶40,可经受致死量病毒攻击. 结论： RHDV-VLPs的获得及其良好的免疫原性,为RHD血清学检测试剂的标准化、亚单位疫苗研制应用奠定基础,同时在转移载体及RHDV受体方面研究亦有潜在应用价值.

关键词：兔出血症病毒 VP60基因昆虫细胞基因表达病毒样颗粒免疫原性亚单位疫苗

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兔出血症病毒抗原捕获ELISA检测方法

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中国比较医学杂志 2007年第8期17卷 I0020-I0024页

作者：秦海斌刘怀然刘家森姜骞韩凌霞司昌德曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部实验动物质量监督检验测试中心西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100

为了有效地预防和根除山羊痘，研制能够区分自然感染和疫苗免疫的标记疫苗。本研究在山羊痘病毒（goat pox virus，GPV）疫苗株AV41胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因克隆、鉴定的基础上，构建转移载体。将痘苗病毒（Vaccinia Virus... 详细信息

为了有效地预防和根除山羊痘，研制能够区分自然感染和疫苗免疫的标记疫苗。本研究在山羊痘病毒（goat pox virus，GPV）疫苗株AV41胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因克隆、鉴定的基础上，构建转移载体。将痘苗病毒（Vaccinia Virus，VV）晚期启动子P11和大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（LacZ）报告基因片段插入含有TK片段同源臂的载体pTK的KpnI酶切位点，经酶切、PCR鉴定出，命名为pTK-LacZ。用脂质体法转染感染了GPVAV41株的犊牛睾丸（bovine testes，BT）细胞，待出现80%以上的细胞病变时收获病毒，经过连续9代蓝色蚀斑筛选、纯化和PCR鉴定，获得纯化的表达LacZ基因、TK功能缺失的重组病毒，命名为rGPV-LacZ。生物学特性研究显示，LacZ基因的插入不影响重组病毒的增殖特性，其毒力、生长特性与亲本株相似，保持原有疫苗株的生长特性，而且在BT细胞和羔羊睾丸（lamb testes，LT）细胞连续传20代遗传性状很稳定。本研究筛选、纯化的重组病毒rGPV-LacZ可以区分自然感染和疫苗免疫动物，为进一步研制山羊痘病毒基因工程标记疫苗奠定了基础。

关键词：重组山羊痘病毒标记疫苗胸苷激酶基因(TK) β-半乳糖苷酶基因(LacZ)

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