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中国畜牧兽医学会2007年学术年会

作者：贺笋王云峰木古丽石星明王玫童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨 150001 新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐 830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨 150001

DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量和免疫原性有直接关系，为了提高目的基因的表达量，增强其免疫效果，本研究对NDV F48E9株的HN基因进行了修饰，将NDV F48E9株的HN基因的密码子全部替换为鸡体内偏嗜性密码子，同时在HN基因的5’端... 详细信息

DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量和免疫原性有直接关系，为了提高目的基因的表达量，增强其免疫效果，本研究对NDV F48E9株的HN基因进行了修饰，将NDV F48E9株的HN基因的密码子全部替换为鸡体内偏嗜性密码子，同时在HN基因的5’端加上同样已替换密码子的禽流感病毒HA蛋白信号肽序列。修饰后HN基因命名为SoptiHN，剔除信号肽的HN基因命名为optiHN。将SoptiHN、optiHN和F48E9株的HN基因分别克隆到真核表达载体pVAX1和含有多个鸡体内最适免疫刺激序列CpG-ODN的载体pVAX1-CpG中，将他们分别命名为pV-SopliHN、pVC-SoptiHN、pV-optiHN、pVC-optiHN和pV-HN、pVC-HN，用这些质粒转染293T细胞，48h后间接免疫荧光和West-blotting检测细胞中瞬时表达的HN蛋白。结果显示，与未经修饰的HN基因相比，修饰后的HN基因体外瞬时表达水平明显提高，并且密码子优化与添加信号肽序列这两种途径都可以提高HN基因的体外表达量。将质粒pVAx1、pvAx1-CpG、pV-HN、pVC-HN、pV-Sop-tiHN和pVC-SoptiHN采用四头肌多点注射三周龄SPF鸡，每只鸡200μg，PBS设为空对照组;一免后三周以相同的剂量加强免疫，二免后以103 EID50 NDV的F48E9强毒株进行攻毒，计算发病率、死亡率、以及排毒情况。免疫前后，及攻毒前后每周采集血清和外周血淋巴计算Ⅷ抗体和细胞因子IFN-γ和IL-18动态变化情况。分析结果表明，相比NDV F48E9马株的HN基因而言，修饰后的HN基因可以诱导更加强烈的免疫反应，产生更好的保护效率。

关键词：鸡新城疫病毒 DNA疫苗密码子优化信号肽免疫印迹

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鸡马立克氏病病毒814株细菌人工染色体的构建

鸡马立克氏病病毒814株细菌人工染色体的构建

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中国畜牧兽医学会2007年学术年会

作者：崔红玉王云峰石星明童光志兰德松何来仇华吉刘长军王玫中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨 150001 河北北方学院动物科技学院动物医学系张家口 075131 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨 150001

本研究通过构建表达Eco-gpt(Xanthine-guaninephosphoribosyl transferase，XGPRT，gpt)的哺乳动物细胞基因转移遗传选择标记(1.3kb)和带有细菌人工染色体(BacterialArtificial Chromosome，BAC)基本功能基因序列的鸡马立克氏病病毒重组病毒转移载体pUAB-gpt-BAC11，将重组病毒转移栽体与鸡马立克氏病病毒细胞总DNA共转染鸡胚成纤维细胞，在选择培养基中经过加压筛选，获得并纯化重组病毒;将重组病毒细胞总DNA电转化大肠杆菌，筛选共获得38个BAC分子克隆化病毒，提取BAC-DNA转染鸡胚成纤维细胞以拯救重组病毒。结果，再次启动病毒感染，拯救了重组鸡马立克氏病病毒。本研究成功构建了鸡马立克氏病病毒814株基因组全长感染性细菌人工染色体，为病毒的反向遗传操作提供技术平台。

关键词：鸡马立克氏病病毒细茵人工染色体分子克隆化病毒病毒感染分子克隆

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

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2007年中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会学术研讨会

作者：郝晓芳周艳君田志军韦天超安同庆彭金美华荣虹童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001

2006年5月以来，我国部分猪场爆发一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病，经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有nsp2部分缺失的对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的。本实验参考GenBank发表的... 详细信息

2006年5月以来，我国部分猪场爆发一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病，经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有nsp2部分缺失的对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的。本实验参考GenBank发表的以及本实验室分离鉴定的PRRSV的nsp2基因序列，在紧靠上述nsp2缺失区的两端的保守区设计并合成了一对引物，建立了一种PRRSV的RT-PCR检测方法。该方法扩增高致病性PRRSV基因组获得230bp的片段，扩增经典型PRRSV时则获得320bp的片段，通过RT-PCR产物大小可将二者区分开来。通过大量临床病料的检测，配合PCR产物测序验证，结果表明该方法简便、快速、特异，可以鉴别高致病性PRRSV，为进一步的PRRS流行病学研究提供了重要的技术手段。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒基因缺失鉴别诊断

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火鸡疱疹病毒细菌人工染色体的构建

火鸡疱疹病毒细菌人工染色体的构建

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第七届全国病毒学学术研讨会暨第二届武汉现代病毒学国际研讨会

作者：兰德松崔红玉石星明王云峰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室河北北方学院动物科技学院

HVT 为一种α疱疹病毒,因其与 MDV 抗原相关性而被广泛用作预防 MD 的活疫苗。本研究利用 Eco-gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)基因和细菌人工染色体(BAC)载体 pBeloBAC11的基本功能序列,构建了重组病毒转移载体

关键词：火鸡疱疹病毒病毒拯救细菌人工染色体 BAC 分子克隆化病毒

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乙型脑炎病毒E蛋白的分段表达与免疫性分析

乙型脑炎病毒E蛋白的分段表达与免疫性分析

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：闫丽萍华荣虹亓文宝童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室华南农业大学兽医学院

流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)可导致中枢神经系统损伤,且人畜共患,是世界范围内急性病毒型脑炎流行的最主要形式之一。猪患流行性乙型脑炎的主要表现为怀孕母猪流产、产死胎或弱仔,公猪则患睾丸炎,仔猪呈神经症状,常使养... 详细信息

流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)可导致中枢神经系统损伤,且人畜共患,是世界范围内急性病毒型脑炎流行的最主要形式之一。猪患流行性乙型脑炎的主要表现为怀孕母猪流产、产死胎或弱仔,公猪则患睾丸炎,仔猪呈神经症状,常使养猪业遭受巨大损失。目前尚无简便快速的诊断方法和特效的治疗药物。E蛋白是主要的毒粒抗原,参与病毒复制的许多重要过程,包括受体结合、膜融合、毒粒包装等。E蛋白上有特异性抗体的中和表位,可诱导免疫动物产生中和抗体。E蛋白在体外进行高效表达不仅有利于该蛋白结构与功能的深入研究,而且有利于开发新型疫苗(亚单位疫苗)和诊断试剂的开发。为了对JEV E蛋白的免疫特性进行分析,本试验依据E蛋白的空间结构特点把全长E基因分成3段,成功地在***中高效融合表达EF1、EF2、EF3蛋白,通过Western blot和ELISA鉴定确定EF1、EF2融合蛋白与JEV阳性血清反应。且GST-EF2反应信号最强,而对照GST和GST-EF3没有反应。由于EF1片段长为873bp,所以将其进一步细分(EF1-1、EF1-2、EF1-3、EF1-4),每段间约有20bp的重叠,进行融合表达及检测,结果发现4段均与JEV阳性血清有强的反应性。通过本实验证明了EF1、EF2片段1～402aa是E蛋白中的免疫优势决定区,包括了12个Cys的保守区及域I、域П和域Ⅱ3个主要抗原域。通过Western blot和ELISA鉴定证明了表达的蛋白具有较好的抗原性。本研究结果对进一步进行鉴定E蛋白的抗原表位和基于这些抗原表位序列的应用研究具有重要意义。

关键词：乙型脑炎病毒 ELISA Western 抗原表位阳性血清分段表达免疫性

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乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定

乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：闫丽萍华荣虹亓文宝童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室华南农业大学兽医学院

流行性乙型脑炎（Epidemic Encephalitis B;Japanese Encephalitis,JE）简称乙脑,是由乙型脑炎病毒（Epidemic Encephalitis B Virus;Japanese Encephalitis Virus,JEV）引起的中枢神经系统疾病,由蚊虫传播,主要流行于东亚和东南亚各国,近年来其流行分布范围有不断扩大的趋势。感染后死亡率高,愈后患者会留下不同程度的后遗症。JEV的囊膜蛋白（即E蛋白）是乙脑病毒的主要结构蛋白,它在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。1999年Kolaskar等[1]通过对E蛋白抗原表位的三维结构预测,认为E蛋白的三维结构主要由3个结构域组成,其中结构域Ⅱ独立地在病毒表面折叠成为免疫球蛋白样结构,由于这种构象,许多抗原中和表位都集中于此结构域。目前对于E蛋白的结构域Ⅱ（EⅡ）的抗原表位还不清楚,为了对结构域Ⅱ进行抗原表位研究,首先原核克隆表达了EⅡ,结果表明,原核表达产物可被抗JEV阳性血清识别。并且利用一组覆盖该区域的短肽融合蛋白通过蛋白免疫印迹和ELISA反应,进行表位鉴定,同时也对结构域Ⅱ的免疫特性进行了研究。为了对EⅡ（292～402氨基酸残基）这一长111氨基酸残基的片段进行抗原表位作图,设计了一套覆盖整个EⅡ的短肽组,命名为E3750,这些短肽长为16个氨基酸,相互重叠8个氨基酸。为了表达这些短肽,设计合成了14对寡核苷酸链。在编码链的5'端引入BamH I位点,在3'端引入XhoI位点,反义链与编码链互补,且退火后形成的双链DNA正向为BamH I粘性末端,反向为XhoI粘性末端,可直接与酶切线性化处理的载体pGEX-6P-1相连接。重组子经酶切鉴定后命名为pGEX-E37至pGEX-E50,各重组质粒送北京英骏生物技术有限公司测序以验证序列。将重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21,进行诱导表达及SDS-PAGE电泳分析各短肽蛋白表达情况。从分析结果看各融合蛋白均获得了表达,可溶性短肽融合蛋白用谷胱甘肽Sepharose4B RediPack亲和层析柱（Pharmacia Biotech）纯化,不溶性短肽融合蛋白经超声波洗涤纯化.纯化样品与1:100稀释的JEV阳性血清进行蛋白质免疫印迹和ELISA分析,结果表明,表达融合蛋白GST-E39（305～320）,GST-E45（353～368）,GST-E47（369～384）,GST-E48（377～392）,和E49（385～402）能被JEV阳性血清所识别。由于GST-E47、GST-E48、GST-E49是一个连续的氨基酸序列,为了确定抗原表位的主要功能性区域,将该段氨基酸进一步划分,通过蛋白质印迹结果表明该区域含有两个抗原表位,即GST-E48-1（377～384）、GST-E49（385～402）。同时,由于鉴定出的表位E45（353～368）的融合蛋白以包涵体的形式存在对E45进行相应的细分,蛋白质印迹结果发现E45-1（355～366）能被JEV阳性血清所识别。14个相互重叠且覆盖EⅡ全长区域的短肽融合蛋白经JEV阳性血清免疫印迹及ELISA扫描,以及通过免疫印迹进一步精确定位后,最终确定GST-E39、GST-E45-1、GST-E48-1、GST-E494个抗原表位,表位作图如下其结果对进一步分析JEV E蛋白结构与功能以及诊断试剂和基因工程疫苗的研究有重要意义。

关键词：抗原表位结构域免疫印迹 ELISA 乙型脑炎病毒阳性血清 JEV

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传染性喉气管炎病毒WG株糖蛋白gJ基因的克隆与表达

传染性喉气管炎病毒WG株糖蛋白gJ基因的克隆与表达

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

作者：何来王云峰石星明崔红玉韩文雄兰德松王玫童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室河北北方学院动物科技学院动物医学系

根据GenBank中已发表的传染性喉气管炎病毒全基因组序列（NC006233）设计引物,以传染性喉气管炎病毒WG株基因组为模板,PCR扩增糖蛋白gJ基因并对其序列分析。用DNAStar软件分析gJ蛋白的抗原性,选择抗原性强的140aa83aa片段,克隆并连接到... 详细信息

根据GenBank中已发表的传染性喉气管炎病毒全基因组序列（NC006233）设计引物,以传染性喉气管炎病毒WG株基因组为模板,PCR扩增糖蛋白gJ基因并对其序列分析。用DNAStar软件分析gJ蛋白的抗原性,选择抗原性强的140aa83aa片段,克隆并连接到原核表达载体pET-32a（+）中,转化BL2（1DE3）菌株。经IPTG诱导后,获得大小为65.2kD的重组蛋白,命名为r-gJ,表达量占菌体蛋白总量的60.8%;Western blot分析表明r-gJ具有较强的抗原性。

关键词：传染性喉气管炎病毒糖蛋白J(gJ) 序列分析表达抗原性

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流行性乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定与功能研究

流行性乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定与功能研究

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第三次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会

作者：闫丽萍华荣虹亓文宝童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨 150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 华南农业大学兽医学院广东广州510642

流行性乙型脑炎病毒(JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒.E蛋白是该病毒的主要结构蛋白.E蛋白在介导病毒与宿主细胞的吸附,融合;决定病毒的血凝活性、细胞嗜性以及决定病毒毒力和诱导宿主产生保护性免疫反应中起重要作用.E蛋白结构域... 详细信息

流行性乙型脑炎病毒(JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒.E蛋白是该病毒的主要结构蛋白.E蛋白在介导病毒与宿主细胞的吸附,融合;决定病毒的血凝活性、细胞嗜性以及决定病毒毒力和诱导宿主产生保护性免疫反应中起重要作用.E蛋白结构域Ⅲ(EⅢ)是诱导中和抗体的重要区域.为确定乙型脑炎EⅢ的抗原表位,本实验首先克隆了JEV疫苗株SA14-14-2的EⅢ区域,并用pGEX-6P-1载体进行融合表达,免疫印迹分析表明,该融合蛋白能被抗JEV血清识别.为了进一步对该结构域进行抗原表位作图,设计了14个覆盖该区域且部分重叠的短肽.将各短肽与GST进行融合表达与纯化.短肽融合蛋白经JEV阳性血清免疫印迹和ELISA免疫反应性扫描分析,结果鉴定出E39(<'305>TEKFSFAKNPVDTGHG<'320>)、E45-1(<'355>VTVNPFVATSSA<'366>)、E48-1(<'377>PFGDSYIV<'384>)和E49(<'385>VGRGDKQINHHWHKAG<'400>)四个线性抗原表位.分别将4个抗原表位融合蛋白免疫小鼠,制备各抗原表位单因子血清,结果经体外病毒中和试验表明E39为具有病毒中和活性的抗原表位.本试验结果为进一步分析JEV E蛋白结构与功能以及诊断试剂和表位疫苗的研究提供了重要工作基础.

关键词：流行性乙型脑炎病毒 E蛋白结构域Ⅲ 抗原表位鉴定免疫印迹表位疫苗

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乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定

乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定

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2007年中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会学术研讨会

作者：闫丽萍华荣虹亓文宝童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 华南农业大学兽医学院广东广州510642

流行性乙型脑炎是一种由蚊虫传播的病毒性人兽共患病，乙型脑炎病毒是该病毒的病原E蛋白是乙型脑炎病毒的主要结构蛋白，它在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。而E蛋白结构域Ⅲ是诱导中... 详细信息

流行性乙型脑炎是一种由蚊虫传播的病毒性人兽共患病，乙型脑炎病毒是该病毒的病原E蛋白是乙型脑炎病毒的主要结构蛋白，它在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。而E蛋白结构域Ⅲ是诱导中和抗体的重要区域。为了分析鉴定乙型脑炎E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位，首先克隆并用pGEX-6P-1载体融合表达了乙型脑炎病毒疫苗株sA14-14-2的该区域，通过免疫印迹分析表明，该区域融合蛋白能被JEV阳性血清所识别。为了对这一区域进行抗原表位作图，进一步设计了一套14个覆盖该区域的部分重叠短肽，并进行了GST融合表达，用JEV阳性血清对14个融合蛋白进行免疫印迹和ELISA免疫反应性分析，鉴定出4个线性抗原表位E39(305TEKFSFAKNPVDTGHG320)、FA5-1(355VTVNPFVATSSA 366)、E48-l(377PFGDSYIV384)、E49(385VGRGDKQINHHWHKAG400)。本试验结果对进一步分析乙脑病毒E蛋白结构与功能以及诊断试剂和表位疫苗的研究有重要意义。

关键词：乙型脑炎病毒抗原表位人兽共患病免疫反应

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山羊痘基因工程标记疫苗的初步研究

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中国比较医学杂志 2007年第8期17卷 I0015-I0015页

作者：王芳刘胜旺邵昱昊陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001

为了有效地预防和根除山羊痘,研制能够区分自然感染和疫苗免疫的标记疫苗。本研究在山羊痘病毒(goat pox virus,GPV)疫苗株AV41胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因克隆、鉴定的基础上,构建转移载体。将痘苗病毒(Vaccinia Virus,VV)晚期... 详细信息

为了有效地预防和根除山羊痘,研制能够区分自然感染和疫苗免疫的标记疫苗。本研究在山羊痘病毒(goat pox virus,GPV)疫苗株AV41胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因克隆、鉴定的基础上,构建转移载体。将痘苗病毒(Vaccinia Virus,VV)晚期启动子P11和大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(LacZ)报告基因片段插入含有TK片段同源臂的载体pTK的KpnI酶切位点,经酶切、PCR鉴定出,命名为pTK-LacZ。用脂质体法转染感染了GPVAV41株的犊牛睾丸(bovine testes,BT)细胞,待出现80%以上的细胞病变时收获病毒,经过连续9代蓝色蚀斑筛选、纯化和PCR鉴定,获得纯化的表达LacZ基因、TK功能缺失的重组病毒,命名为rGPV-LacZ。生物学特性研究显示,LacZ基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力、生长特性与亲本株相似,保持原有疫苗株的生长特性,而且在BT细胞和羔羊睾丸(lamb testes,LT)细胞连续传20代遗传性状很稳定。本研究筛选、纯化的重组病毒rGPV-LacZ可以区分自然感染和疫苗免疫动物,为进一步研制山羊痘病毒基因工程标记疫苗奠定了基础。

关键词：重组山羊痘病毒标记疫苗胸苷激酶基因(TK) β-半乳糖苷酶基因(LacZ)

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