检索结果-内蒙古大学图书馆

猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

畜牧兽医学报 2025年第1期56卷 319-326页

作者：曾苗苗杨小曼张鑫刘大凯时洪艳张记宇张燎原陈建飞冯廷帅李修文石达冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/猪消化道传染病创新团队哈尔滨150069

为建立一种猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)血清抗体的快速检测方法,本研究首先经PCR扩增SADS-CoV N基因,纯化鉴定后克隆至表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。重组N蛋白诱导表达并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用... 详细信息

为建立一种猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)血清抗体的快速检测方法,本研究首先经PCR扩增SADS-CoV N基因,纯化鉴定后克隆至表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。重组N蛋白诱导表达并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,以兔抗猪HRP-IgG作为二抗,利用方阵滴定法优化各反应条件,建立了一种以SADS-CoV N蛋白为靶标的检测SADS-CoV血清抗体的间接ELISA方法,并对此方法的敏感性、特异性、重复性及临床应用价值进行鉴定。SDS-PAGE及Western blot结果显示,重组表达的N蛋白约为70 ku,且具有良好的反应原性。采用该方法检测SADS-CoV阳性血清抗体效价可达1∶3 200,并且与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒(PCV)阳性血清均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有较好的重复性。利用该方法和间接免疫荧光方法(IFA)分别对50份猪临床血清样品进行检测,结果显示二者的总符合率为98%。综上,本研究建立了一种基于SADS-CoV N蛋白的间接ELISA抗体检测方法,可用于临床SADS-CoV血清抗体检测以及流行病学的监测,对防控SADS-CoV的流行具有重要意义。

关键词：猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV) N蛋白原核表达间接ELISA

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马源白介素受体拮抗因子的表达及其体外抗炎机制的研究

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中国预防兽医学报 2025年第2期47卷 185-193页

作者：李柄霖李佳欣郭兴林跃智王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/马传染病与慢病毒病创新团队黑龙江哈尔滨150069

白介素受体拮抗因子(IL-1Ra)是细胞因子IL-1家族的主要成员,也是一种重要的抗炎因子。为评估马源IL-1Ra在马属动物中的抗炎潜力,本研究构建原核表达质粒p GEX-6p-1-IL-1Ra,经测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),于不同温度下经IPTG诱... 详细信息

白介素受体拮抗因子(IL-1Ra)是细胞因子IL-1家族的主要成员,也是一种重要的抗炎因子。为评估马源IL-1Ra在马属动物中的抗炎潜力,本研究构建原核表达质粒p GEX-6p-1-IL-1Ra,经测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),于不同温度下经IPTG诱导表达后,利用GST标签蛋白纯化试剂盒纯化后通过SDS-PAGE检测重组IL-1Ra蛋白(rIL-1Ra)的表达及纯化效果。结果显示,在16℃、25℃、37℃诱导后,均在43 ku处出现目的条带,且纯化后的目的条带单一。通过流式细胞术检测不同浓度rIL-1Ra对巨噬细胞凋亡的影响;采用单荧光素酶试验检测不同浓度rIL-1Ra在各时间点对IL-1β激活的NF-κB荧光素酶报告系统活性的影响(由各实验组与阴性对照组荧光值的比值确定);采用间接免疫荧光试验(IFA)检测rIL-1Ra对NF-κB信号通路中P65蛋白细胞内定位的影响;通过荧光定量PCR(qPCR)检测rIL-1Ra对LPS诱导炎症细胞因子转录水平的影响。流式细胞术结果显示,不同浓度rIL-1Ra作用的马巨噬细胞凋亡比例均约2%,与阴性对照组均无显著差异。证明不同浓度r IL-1Ra对马巨噬细胞的凋亡无影响。单荧光素酶试验结果显示,作用4 h后,与IL-1β+PBS组相比,IL-1β+rIL-1Ra组与阴性对照组细胞荧光值的比值均极显著降低(P<0.0001),且当rIL-1Ra浓度≥1.4 ng/m L时,与IL-1β+PBS组相比,IL-1β+rIL-1Ra组与阴性对照组细胞荧光值的比值均显著和极显著降低(P<0.05、P<0.001、P<0.0001)。IFA结果显示,与阴性对照组相比,加入IL-1β后细胞核内的红色荧光强度提高并聚集,且随着IL-1β剂量的增加荧光逐渐增强。但IL-1β+rIL-1Ra组细胞核中的荧光减弱并逐渐消失。qPCR检测结果显示,与阴性对照组相比,在LPS刺激后细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α的转录水平均极显著升高(P<0.01、P<0.001、P<0.0001)。但在LPS作用后4 h~8 h加入不同浓度(250 ng/m L~2000 ng/m L)rIL-1Ra的细胞中上述细胞因子的转录水平均显著和极显著降低(P<0.05、P<0.001、P<0.0001)。上述结果表明,马源rIL-1Ra对马巨噬细胞的凋亡无影响,能够有效拮抗IL-1β的活性,抑制IL-1β诱导P65蛋白的核易位,并抑制LPS诱导的马巨噬细胞的炎症反应。本研究为马属动物炎症性疾病的治疗提供了新的策略和参考依据,同时为后续优化rIL-1Ra的生物学特性及体内应用研究奠定了基础。

关键词：马源IL-1Ra 马属动物抗炎作用基因克隆原核表达

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基于单克隆抗体的O型口蹄疫病毒抗体固相竞争ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2020年第2期42卷 145-149页

作者：许智强李敏杰刘彦玲周国辉于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病研究创新团队

为建立评价O型口蹄疫病毒(FMDV)疫苗免疫水平的方法,本研究以单克隆抗体(MAb)3D9为捕获抗体,以HRP标记的MAb 8E8作为检测MAb,经过条件优化建立了基于MAb的检测O型FMDV抗体的固相竞争ELISA(SPCE)方法。对该方法进行了特异性、敏感性、重... 详细信息

为建立评价O型口蹄疫病毒(FMDV)疫苗免疫水平的方法,本研究以单克隆抗体(MAb)3D9为捕获抗体,以HRP标记的MAb 8E8作为检测MAb,经过条件优化建立了基于MAb的检测O型FMDV抗体的固相竞争ELISA(SPCE)方法。对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,MAb 3D9的最佳稀释度为1:25 000,灭活O型FMDV抗原的最佳稀释浓度为1:3,HRP标记的MAb 8E8的最佳稀释度为15 000,当血清1:32稀释时,检测的临界值确定为45%。该方法分别检测A型FMDV抗体阳性参考血清以及牛冠状病毒、牛轮状病毒以及猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒的标准阳性血清,检测结果均为阴性,未出现交叉反应。经检测,当阳性标准血清的抗体稀释度在1:512时,该方法仍具有较好的敏感性;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明其重复性较好。并将该方法与液相阻断ELISA(LPBE)方法和病毒中和试验(VNT)的相关性进行了比较,结果显示该方法与LPBE和VNT的相关性分别为0.896和0.923。本研究为国内评价O型FMDV疫苗免疫水平建立了一种新的方法。

关键词：口蹄疫病毒单克隆抗体固相竞争ELISA

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我国东北部分地区牛溶血性曼氏杆菌的分子流行病学研究

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中国预防兽医学报 2020年第6期42卷 555-560页

作者：姜志刚李奕欣于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为了解牛溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)在我国牛群中的流行情况,本研究于2014年~2019年在东北部分地区采集健康牛、患病牛的鼻拭子和肺脏样品进行细菌的检测、分离和鉴定,并对分离株进行遗传进化分析。对牛溶血性曼氏杆菌... 详细信息

为了解牛溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)在我国牛群中的流行情况,本研究于2014年~2019年在东北部分地区采集健康牛、患病牛的鼻拭子和肺脏样品进行细菌的检测、分离和鉴定,并对分离株进行遗传进化分析。对牛溶血性曼氏杆菌的检测结果显示,不同年份、不同地区采集样品的总检出率为23.5%(28/119),其中健康牛的检出率为13.46%(7/52),明显低于临床发病或死亡牛样品的检出率31.34%(21/67)。采用特异性分型PCR检测发现,Mh分离株分为A1、A2和A6三个血清型,从健康牛分离的Mh株的主要血清型为A2型,而从发病或死亡牛主要分离的Mh是A1和A6型。遗传进化分析表明,A1和A6型分离株位于同一进化分支,菌株间16S rDNA和lktA基因的序列同源性均为100%;而它们与A2型分离株的亲缘关系较远,16S rDNA和lktA基因的序列同源性分别为99.8%~99.9%和85.8%~86.7%;此外,A1和A6型分离株的lktA同属于lktA1等位基因亚型,而A2型分离株属于lktA2和lktA8亚型,与A1和A6型相比呈现出较强的序列多样性。综上所述,Mh在我国东北部分地区牛群中的存在较为普遍,且A1和A6血清型是牛群中Mh的主要致病血清型。本研究获得的流行病学数据为我国牛群中溶血性曼氏杆菌的病原学以及疫苗研究提供科学依据。

关键词：牛溶血性曼氏杆菌流行病学调查血清型鉴定进化分析

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虫媒病毒与牛羊繁殖障碍性疾病

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中国预防兽医学报 2016年第6期38卷 507-512页

作者：王芳齐瑛琳于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队黑龙江哈尔滨150001

牛羊传染性疾病,在我国习惯上划分为烈性传染病口蹄疫、羊的小反刍兽疫及羊痘、人畜共患病布鲁氏杆菌病和牛结核以及多系统性传染病,后者包括以呼吸道疾病综合症为特征的呼吸系统疾病、以腹泻为特征的消化系统疾病和以流产为特征的繁殖... 详细信息

牛羊传染性疾病,在我国习惯上划分为烈性传染病口蹄疫、羊的小反刍兽疫及羊痘、人畜共患病布鲁氏杆菌病和牛结核以及多系统性传染病,后者包括以呼吸道疾病综合症为特征的呼吸系统疾病、以腹泻为特征的消化系统疾病和以流产为特征的繁殖障碍性疾病。繁殖障碍性疾病（Reproductive disorders diseases）即感染生殖系统的疾病,

关键词：繁殖障碍性疾病虫媒病毒烈性传染病疾病综合症人畜共患病小反刍兽疫牛结核阿卡斑病布鲁氏杆菌病中山病

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荚膜A型多杀性巴氏杆菌引起牛纤维素性化脓性肺炎:病原引起疾病因果关系的确定

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中国预防兽医学报 2017年第12期39卷 963-968页

作者：姜志刚徐和敏邵葳潘春刚于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069 中牧实业股份有限公司北京100070

2006年底本研究室在牛群中发现了病因不明的牛纤维素性化脓性肺炎疫情,该疫情已蔓延至中国的多个养牛地区,本研究室从发病牛肺脏中分离得到荚膜A型多杀性巴氏杆菌。为确定该菌与牛纤维素性化脓性肺炎的病原-疾病因果关系,本研究从病原... 详细信息

2006年底本研究室在牛群中发现了病因不明的牛纤维素性化脓性肺炎疫情,该疫情已蔓延至中国的多个养牛地区,本研究室从发病牛肺脏中分离得到荚膜A型多杀性巴氏杆菌。为确定该菌与牛纤维素性化脓性肺炎的病原-疾病因果关系,本研究从病原流行病学调查、病原对实验动物的致病性与免疫保护性以及病原回归本动物致病特征3个方面,对其进行验证性研究。调查结果显示,在2008年~2014年采集的88份发病牛肺脏样品中,荚膜A型多杀性巴氏杆菌的PCR阳性率高达86.36%,而且PCR阳性样品中该菌的分离率高达90.79%。将现地分离株接种小鼠进行动物实验,结果显示,该菌具有高度致死性,而且灭活菌体接种小鼠对活菌攻击呈现良好的免疫保护性。动物回归试验结果显示,健康犊牛接种该分离菌株后出现与自然感染病例相似的纤维素性化脓性肺炎,免疫组化试验显示该菌株分布于病变肺组织、并从中重新分离出接种的病原菌。上述研究结果符合病原微生物鉴定的科赫法则,因此确定荚膜A型多杀性巴氏杆菌是引起牛纤维素性化脓性肺炎的病原。荚膜A型多杀性巴氏杆菌与牛纤维素性化脓性肺炎病原-疾病因果关系的确立,为该新发疫情防控技术的研究提供了参考依据、奠定了实验基础。

关键词：荚膜A型Pm 牛纤维素性化脓性肺炎流行病学调查致病性

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猪肠道组织RIG-I的表达及其在猪传染性胃肠炎病毒致病机制中作用的初步研究

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中国预防兽医学报 2023年第2期45卷 161-168页

作者：王文哲李亮何豪杰薛美冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪消化道传染病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为探究天然免疫分子维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-I)在猪肠道组织中的表达情况,评价其在猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)致病机制中的作用。本研究经原核表达重组RIG-I蛋白(rRIG-1)并采用SDS-PAGE切胶纯化该蛋白,将其免疫大白兔制备兔RIG-I多克隆抗体... 详细信息

为探究天然免疫分子维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-I)在猪肠道组织中的表达情况,评价其在猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)致病机制中的作用。本研究经原核表达重组RIG-I蛋白(rRIG-1)并采用SDS-PAGE切胶纯化该蛋白,将其免疫大白兔制备兔RIG-I多克隆抗体,采用间接ELISA检测抗体效价。结果显示获得了效价可达1∶64000的兔RIG-I多克隆抗体。利用该抗体经western blot检测SPF猪各肠道组织中RIG-I的表达。结果显示,制备的多克隆抗体可与猪各肠道中的RIG-I反应,且RIG-I在SPF猪空肠中的表达量最高。利用该抗体经western blot检测TGEV感染的ST细胞及猪空肠中RIG-I的表达水平。结果显示,TGEV感染后ST细胞中RIG-I的表达水平极显著高于空白对照细胞(P<0.01);与正常SPF猪空肠相比,TGEV感染的SPF猪空肠组织中RIG-I蛋白的表达水平明显提高。表明TGEV感染后能够刺激细胞内源性及感染猪肠道组织中RIG-I蛋白的表达水平。将本研究构建的重组质粒pCAGGS-RIG-I-flag和RIG-I干扰RNA(siRIG-I)分别转染ST细胞,采用western blot鉴定RIG-I的过表达和敲低效果后,再利用TGEV感染,24 h后采用qPCR检测RIG-I对上述ST细胞中IFN-β转录水平的影响;收集细胞上清,采用TCID50方法测定病毒滴度。qPCR及病毒滴度的测定结果显示,与转染空载体的对照组相比,RIG-I过表达的ST细胞中IFN-β的转录水平极显著升高(P<0.001),且细胞上清中的病毒滴度下降约75%;与转染NCsiRNA的对照组相比,敲低RIG-I的ST细胞中IFN-β的转录水平极显著下降(P<0.001),且细胞上清中的病毒滴度升高约4.8倍。表明,TGEV感染细胞中的RIG-I能够促进细胞中IFN-β的转录,提高宿主细胞的抗病毒免疫反应,从而抑制病毒的复制。本研究结果证实RIG-I在介导TGEV诱导宿主细胞产生IFN的过程中发挥重要作用,该结果为深入探究TGEV的致病机制奠定了实验基础。

关键词：维甲酸诱导基因I(RIG-I) 多克隆抗体猪传染性胃肠炎病毒干扰素β 致病机制

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脑心肌炎病毒IRES置换不影响口蹄疫病毒的复制和毒力

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中国预防兽医学报 2015年第11期37卷 834-837页

作者：高荣远杨德成孙超周国辉王海伟于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队黑龙江哈尔滨150001

内部核糖体进入位点(IRES)是微RNA病毒起始蛋白合成的关键元件。为研究IRES元件在病毒致病过程中的作用,本研究以口蹄疫病毒(FMDV)为模型,在已建立的O型FMDV c DNA感染性克隆的基础上,利用融合PCR的方法以脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES替换F... 详细信息

内部核糖体进入位点(IRES)是微RNA病毒起始蛋白合成的关键元件。为研究IRES元件在病毒致病过程中的作用,本研究以口蹄疫病毒(FMDV)为模型,在已建立的O型FMDV c DNA感染性克隆的基础上,利用融合PCR的方法以脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES替换FMDV的IRES,构建并拯救出含有EMCV IRES的嵌合病毒(r FMDV-EIRES)。一步生长曲线结果显示r FMDV-EIRES无论是在鼠源BHK-21细胞还是在猪源IBRS-2细胞中的复制能力均与亲本病毒相近。另外,r FMDV-EIRES对乳鼠的致病力与亲本病毒也相同。以上研究结果表明,虽然EMCV IRES与FMDV IRES一级序列存在显著差异,但二者的置换并不影响FMDV的复制和毒力,该结果有助于加深IRES在微RNA病毒复制和致病性功能的认识。

关键词：内部核糖体进入位点蛋白翻译起始口蹄疫病毒 IRES嵌合病毒拯救

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O型口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建及其鉴定

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中国预防兽医学报 2014年第8期36卷 611-614页

作者：孙超杨德成高荣远周国辉王海伟于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队黑龙江哈尔滨150001

为构建含有海肾萤光素酶(Rluc)报告基因的O型口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子,本研究在前期构建的O型FMDV cDNA感染性克隆的基础上,利用融合PCR的方法,以Rluc报告基因替换FMDV的前导蛋白Lb基因和结构蛋白P1基因,构建含有Rluc报告基因的F... 详细信息

为构建含有海肾萤光素酶(Rluc)报告基因的O型口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子,本研究在前期构建的O型FMDV cDNA感染性克隆的基础上,利用融合PCR的方法,以Rluc报告基因替换FMDV的前导蛋白Lb基因和结构蛋白P1基因,构建含有Rluc报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDVRep。将该复制子质粒线性化后,经体外转录制备复制子全长RNA,转染BHK-21细胞,通过RT-PCR方法和间接免疫荧光试验分别检测该复制子RNA的自主复制能力以及FMDV非结构蛋白3B的表达情况。结果显示,复制子RNA在BHK-21细胞中能够进行自主复制并且能够表达病毒的非结构蛋白。Rluc活性检测结果表明,该复制子RNA在BHK-21细胞中可以高效表达Rluc,在转染后2 h^12 h Rluc活性呈线性递增,进一步反映该复制子具有良好的表达外源基因的能力。O型FMDV亚基因组复制子的构建,为深入研究FMDV的复制和翻译机制奠定了基础。

关键词： O型口蹄疫病毒海肾萤光素酶复制子

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牛副流感的流行、危害及其防控

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中国预防兽医学报 2016年第8期38卷 667-671页

作者：朱远茂马磊杨婷宋文凤薛飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队黑龙江哈尔滨150001

牛副流感（Bovine parainfluenza）是由牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3）引起的一种急性接触性传染病,曾被称为“船运热”（Shipping fever）。应激因素如运输、转群、气候变化等容易诱发牛副流感病的局部... 详细信息

牛副流感（Bovine parainfluenza）是由牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3）引起的一种急性接触性传染病,曾被称为“船运热”（Shipping fever）。应激因素如运输、转群、气候变化等容易诱发牛副流感病的局部流行。BPIV3感染牛多表现出精神沉郁、

关键词：副流感病毒急性接触性传染病牛防控危害 virus 应激因素气候变化

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