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作者：刘文丽刘怀然刘培欣孔宪刚陈维多中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室东北农业大学生命科学学院

【目的】制备针对新城疫病毒F48E9株单克隆抗体,以用于NDV抗原变异研究及检测方法建立。【方法】用新城疫病毒F48E9株全病毒及原核表达的重组F48E9-NP蛋白免疫BALB/e小鼠,全病毒间接ELISA筛选杂交瘤细胞株。用免疫印迹和间接免疫荧光试... 详细信息

【目的】制备针对新城疫病毒F48E9株单克隆抗体,以用于NDV抗原变异研究及检测方法建立。【方法】用新城疫病毒F48E9株全病毒及原核表达的重组F48E9-NP蛋白免疫BALB/e小鼠,全病毒间接ELISA筛选杂交瘤细胞株。用免疫印迹和间接免疫荧光试验鉴定单抗反应原性,间接ELISA试验鉴定单抗与其他NDV毒株的交叉反应,并采用NP蛋白分段融合表达技术对单抗识别区域初步定位。【结果】共筛选到3株单抗杂交瘤细胞株3E7、2D11和4B12,免疫印迹和间接免疫荧光试验分析表明,3株单抗均针对病毒NP蛋白的线性表位;单抗3E7、4B12与基因I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅶ型共11株NDV均有反应性,单抗2D11仅与基因Ⅶ型中QY97、Mallard/CH/HLJ001/06和基因Ⅲ型中Mutkaswar株反应。单抗2D11识别NP基因开放阅读框C端的1303-1413处(37个aa);单抗3E7、4B12识别NP基因ORF C端的1372-1470处(共33个aa)。【结论】获得了针对NDVF48E9株NP蛋白的3株识别线性表位单抗,将在NDV抗原变异研究及检测方法建立方面进行应用。

关键词：新城疫病毒 F48E9 NP蛋白单克隆抗体

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多重PCR方法用于检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断方法的建立

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养猪 2010年第3期 41-44页

作者：岳丰雄崔尚金冉多良戚亭周盛华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

本文建立了一种能够同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的多重PCR方法(mPCR)。借助于Oligo6.0引物设计软件,设计了4对引物分别用于扩增PCV2ORF2基因353bp片段、PPVNS-... 详细信息

本文建立了一种能够同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的多重PCR方法(mPCR)。借助于Oligo6.0引物设计软件,设计了4对引物分别用于扩增PCV2ORF2基因353bp片段、PPVNS-1基因271bp片段、PRRSVMN基因美洲型434bp片段、PRVgB基因194bp片段。通过人为混合以上4种病毒进行特异性及敏感性试验,结果表明,该方法具有很好的特异性和敏感性。对猪瘟病毒、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;该mPCR方法对PPV的最低检测量为8.64×10-3μg,PRV的最低检测量为2.36×10-3μg,PRRSV的最低检测量为3.68×10-3μg,PCV2的最低检测量为2.90×10-4μg。该方法的建立对临床上PCV2、PPV、PRV、PRRSV的鉴别诊断以及以上这4种病毒的流行病学调查具有十分重要的意义。

关键词：多重PCR方法猪圆环病毒2型猪细小病毒猪伪狂犬病病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒

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猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白抑制MG132诱导的细胞凋亡作用

猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白抑制MG132诱导的细胞凋亡作用

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：唐青海张彦明郭抗抗何雷范丽仝刚代晨西北农林科技大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

为研究猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白对宿主细胞凋亡的影响,本研分别将CSFV NS2基因和E2基因与GFP在猪血管内皮细胞中进行融合表达,以MG132为细胞凋亡诱导剂诱导细胞凋亡,并采用流式细胞仪和Hoechst33342染色方法检测细胞凋亡率。结果表明,MG13... 详细信息

为研究猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白对宿主细胞凋亡的影响,本研分别将CSFV NS2基因和E2基因与GFP在猪血管内皮细胞中进行融合表达,以MG132为细胞凋亡诱导剂诱导细胞凋亡,并采用流式细胞仪和Hoechst33342染色方法检测细胞凋亡率。结果表明,MG132能够诱导正常猪血管内皮细胞及稳定表达CSFV E2蛋白和GFP蛋白的细胞株的凋亡,而且,凋亡率呈MG132剂量依赖性增加。而稳定表达CSFV NS2蛋白的细胞株能够对抗MG132诱导的细胞凋亡。深入的研究还显示,表达CSFV NS2蛋白的细胞株能够对抗MG132对宿主细胞NF-κB活性的抑制作用,而且,表达NS2蛋白细胞中的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量比照组细胞增加了48倍～51倍。该研究表明,CSFV NS2蛋白在抑制宿主细胞凋亡中发挥重要作用。

关键词：猪瘟病毒 NS2蛋白 MG132 凋亡 Bcl-2

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猪瘟病毒NS2蛋白的亚细胞定位及其对细胞增殖和周期的调节作用

猪瘟病毒NS2蛋白的亚细胞定位及其对细胞增殖和周期的调节作用

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：唐青海张彦明范丽仝刚何雷代晨西北农林科技大学动物医学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

为了探明猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白的亚细胞定位特征及其对宿主细胞增殖与周期的影响,本研究采用RT-PCR方法扩增CSFV NS2基因,采用激光共聚焦技术研究了CSFV NS2蛋白的亚细胞定位特征;采用MTS方法和流式细胞仪分析了细胞的增殖活性和细胞... 详细信息

为了探明猪瘟病毒(CSFV)NS2蛋白的亚细胞定位特征及其对宿主细胞增殖与周期的影响,本研究采用RT-PCR方法扩增CSFV NS2基因,采用激光共聚焦技术研究了CSFV NS2蛋白的亚细胞定位特征;采用MTS方法和流式细胞仪分析了细胞的增殖活性和细胞周期。结果表明:CSFV NS2蛋白质的分子质量约为53 ku,该蛋白定位于细胞内质网上并诱导宿主细胞内质网应激反应,激活核转录因子NF-κB,促进CyclinA蛋白被蛋白酶体所快速降解,进一步引起细胞周期阻滞于S期,最终抑制宿主细胞的增殖活性,但并不诱导细胞凋亡。本研究首次探明了CSFV NS2蛋白的亚细胞定位特点及该蛋白调节细胞周期与增殖的分子机制,为揭示CSFV致病的分子机制提供了科学依据。

关键词：猪瘟病毒 NS2蛋白亚细胞定位增殖周期

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牛病毒性腹泻病毒1型、猪瘟病毒野毒株和猪瘟病毒疫苗株多重SYBR Green-1实时荧光PCR方法的建立

牛病毒性腹泻病毒1型、猪瘟病毒野毒株和猪瘟病毒疫苗株多重SYBR ...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：王伟符芳陈欣李雪松郎越坤田华彬张兴娟李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院黑龙江哈尔滨 150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨 150001

立可同时检测牛病毒性腹泻病毒-1型(BVDV-1)、猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)与CSFV野毒株的快速检测方法。根据GenBank中登录的上述3种病毒的全基因组序列，设计3对特异性多重引物，建立了同时检测BVDV-1、C株和CSFV野毒株的多重SYBR...

立可同时检测牛病毒性腹泻病毒-1型(BVDV-1)、猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)与CSFV野毒株的快速检测方法。根据GenBank中登录的上述3种病毒的全基因组序列，设计3对特异性多重引物，建立了同时检测BVDV-1、C株和CSFV野毒株的多重SYBR Green-I实时荧光PCR方法。敏感性试验结果表明，本方法能检测到3种病毒的最低病毒含量均为100拷贝/μL;特异性实验结果表明，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PrV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、乙型脑炎病毒(JEV)，均呈阴性;通过批内及批间的重复试验，其变异系数<1％。该方法具有很强的特异性、很高的灵敏度、很好的重复性。

关键词：

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牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型、猪瘟病毒野毒株和猪瘟病毒疫苗株多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR方法的建立

牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型、猪瘟病毒野毒株和猪瘟病毒疫苗株多重SYBR...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：王伟符芳陈欣李雪松郎越坤田华彬张兴娟李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室哈尔滨师范大学生命科学与技术学院东北农业大学

为建立可同时检测牛病毒性腹泻病毒-1型(BVDV-1)、猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)与CSFV野毒株的快速检测方法。根据GenBank中登录的上述3种病毒的全基因组序列,设计3对特异性多重引物,建立了同时检测BVDV-1、C株和CSFV野毒株的多重SY... 详细信息

为建立可同时检测牛病毒性腹泻病毒-1型(BVDV-1)、猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)与CSFV野毒株的快速检测方法。根据GenBank中登录的上述3种病毒的全基因组序列,设计3对特异性多重引物,建立了同时检测BVDV-1、C株和CSFV野毒株的多重SYBR Green-I实时荧光PCR方法。敏感性试验结果表明,本方法能检测到3种病毒的最低病毒含量均为100拷贝/μL;特异性实验结果表明,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PrV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、乙型脑炎病毒(JEV),均呈阴性;通过批内及批间的重复试验,其变异系数<1%。该方法具有很强的特异性、很高的灵敏度、很好的重复性。

关键词： SYBR Green-I实时荧光PCR 牛病毒性腹泻病毒-1型猪瘟病毒野毒株猪瘟兔化弱毒疫苗株

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猪细小病毒病国内流行状况以及防治策略

猪细小病毒病国内流行状况以及防治策略

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会

作者：蔺文成胡峰任梅崔玉东钱爱东崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江八一农垦大学动物科技学院吉林农业大学

猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)引起的一种繁殖障碍疾病,与猪渗出性皮炎、断奶仔猪多系统衰弱综合征等疾病有关,对妊娠母猪与仔猪具有极大的威胁,常给养殖业造成巨大经济损失。

关键词：猪细小病毒病 PPV 混合感染新生仔猪生物技术学间接免疫荧光技术防治策略猪瘟病毒弱毒苗流行状况

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表达猪瘟病毒E2蛋白的BacMam病毒的构建及其免疫原性分析

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生物化学与生物物理进展 2009年第7期36卷 916-922页

作者：李淼王宇飞王煜高辉李娜孙元梁冰冰仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

含具有哺乳动物细胞活性的启动子的重组杆状病毒(BacMam病毒)可有效转导多种哺乳动物细胞,并被广泛用于开发新型非复制型载体疫苗.将水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)基因插入多角体启动子下游,得到经修饰的杆状病毒转移载体,将对虾白斑综合... 详细信息

含具有哺乳动物细胞活性的启动子的重组杆状病毒(BacMam病毒)可有效转导多种哺乳动物细胞,并被广泛用于开发新型非复制型载体疫苗.将水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)基因插入多角体启动子下游,得到经修饰的杆状病毒转移载体,将对虾白斑综合症病毒(WSSV)ie1启动子控制下的猪瘟病毒E2基因表达盒插入此载体中,构建了BacMam病毒BacMam/G-ie1-E2,以其感染Sf9细胞和转导HeLa细胞,通过间接免疫荧光试验和Western blot分析检测E蛋白的表达,同时用BacMam病毒直接免疫小鼠,用检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法检测免疫小鼠血清抗体,用基于CFSE和WST-8的淋巴细胞增殖试验评价其细胞免疫应答.结果显示,BacMam/G-ie1-E2能同时在昆虫细胞和哺乳动物细胞中高效表达E2蛋白,免疫小鼠能诱导产生针对猪瘟病毒的特异性抗体,免疫小鼠脾细胞经猪瘟病毒刺激后能诱导特异性的淋巴细胞增殖.这表明,由BacMam病毒介导的基因转移有望用于开发针对猪瘟病毒的非复制型载体疫苗.

关键词：猪瘟病毒 E2蛋白重组杆状病毒免疫原性

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禽网状内皮组织增生病病毒gp90全长蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性分析

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微生物学报 2009年第10期49卷 1380-1384页

作者：高立祁小乐高宏雷高玉龙秦立廷孙芬芬张云王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

【目的】原核表达免疫原性良好的禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)gp90蛋白,并制备抗gp90蛋白高效价多克隆血清。【方法】利用PCR技术,以pMD18T-env为模板,扩增得到REV的gp90蛋白编码基因,将其克隆入表达载体... 详细信息

【目的】原核表达免疫原性良好的禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)gp90蛋白,并制备抗gp90蛋白高效价多克隆血清。【方法】利用PCR技术,以pMD18T-env为模板,扩增得到REV的gp90蛋白编码基因,将其克隆入表达载体pET-28a(+)中,将构建的原核表达质粒pET28-gp90,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后进行gp90蛋白表达并鉴定。用纯化的gp90蛋白免疫6-8周龄Balb/c小鼠,制备抗gp90的多克隆血清。用间接免疫荧光试验检测该血清的特异性,用酶联免疫吸附试验(ELISA)滴定其效价。【结果】REV gp90基因在重组大肠杆菌中正确表达,免疫小鼠后获得的抗血清可与重组杆状病毒表达的gp90蛋白特异性反应,ELISA效价达到1∶12800,该研究为开展REV诊断试剂的研制奠定了基础。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒 gp90蛋白原核表达纯化多克隆抗体

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猪瘟甲病毒复制子载体DNA疫苗与重组腺病毒活载体疫苗联合免疫效果评价

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生物工程学报 2009年第5期25卷 679-685页

作者：孙元刘大飞王宇飞李娜李宏宇梁冰冰仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

本实验室先前分别将构建的猪瘟病毒E2基因重组腺病毒疫苗(rAdV-E2)和猪瘟甲病毒复制子载体DNA疫苗(pSFV1CS-E2)在猪体上进行了免疫效力评价,结果显示,rAdV-E2免疫组所有猪虽然在加强免疫后产生了比较高的猪瘟特异性中和抗体,但攻毒后个... 详细信息

本实验室先前分别将构建的猪瘟病毒E2基因重组腺病毒疫苗(rAdV-E2)和猪瘟甲病毒复制子载体DNA疫苗(pSFV1CS-E2)在猪体上进行了免疫效力评价,结果显示,rAdV-E2免疫组所有猪虽然在加强免疫后产生了比较高的猪瘟特异性中和抗体,但攻毒后个别猪表现短期体温升高和轻微病变;而pSFV1CS-E2免疫组猪只虽然在攻毒后得到了保护,但产生的抗体水平较低。为了增强猪瘟甲病毒复制子载体疫苗和猪瘟重组腺病毒活载体疫苗的免疫效果,本研究应用了复制子载体DNA疫苗初免和重组腺病毒疫苗加强免疫的初免-加强(Prime-boost)免疫策略,并在猪体上进行了评价。结果显示,所有免疫猪均产生了高水平的猪瘟特异性的中和抗体,用猪瘟强毒攻击后,pSFV1CS-E2初免组所有猪(n=5)均没有出现任何猪瘟的临床症状和病理变化,攻毒后在猪血液中也没有检测到猪瘟病毒RNA,而重组腺病毒初免组(n=5)有一头猪出现短期发热和病毒血症及轻微病理变化。这表明初免-加强免疫策略能显著提高重组疫苗的免疫效力。

关键词：猪瘟甲病毒复制子载体 DNA疫苗重组腺病毒联合免疫

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