检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧兽医学报 2009年第9期40卷 1320-1326页

作者：廖文艳马得莹王瑞琴韩宗玺邵昙昊李慧昕刘胜旺东北农业大学动物营养研究所哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001

旨在从鸭肝脏组织中克隆鸭β-防御素10(AvBD10)基因,并在原核表达重组鸭AvBD10蛋白,研究重组鸭AvBD10蛋白的体外抗菌活性与理化特性。试验采用RT-PCR法,从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD10基因,测定该基因在鸭各组织器官中的分布;将鸭AvBD10基... 详细信息

旨在从鸭肝脏组织中克隆鸭β-防御素10(AvBD10)基因,并在原核表达重组鸭AvBD10蛋白,研究重组鸭AvBD10蛋白的体外抗菌活性与理化特性。试验采用RT-PCR法,从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD10基因,测定该基因在鸭各组织器官中的分布;将鸭AvBD10基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒pGEX-duck AvBD10,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达;亲和层析纯化蛋白,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定重组鸭AvBD10蛋白的体外抗菌活性与理化特性。结果表明,鸭AvBD10 cDNA大小为169bp,编码55个氨基酸残基,与鸡AvBD10氨基酸同源性为85.5%。该基因仅在不同日龄鸭肝脏与肾脏组织中大量表达。重组鸭AvBD10融合蛋白的分子量约为30 ku,重组蛋白占菌体总蛋白的34%。重组鸭AvBD10蛋白对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抗菌活性。结果,从鸭肝脏组织中扩增了鸭AvBD10基因,该基因仅在不同日龄鸭肝脏与肾脏组织中大量表达。重组鸭AvBD10融合蛋白具有广谱抗菌活性,该重组蛋白对温度和酸碱度有很高的稳定性。

关键词：鸭 AvBD10 重组蛋白抗菌活性

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抗猪圆环病毒2型Cap蛋白中和性单克隆抗体的制备及鉴定

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中国预防兽医学报 2009年第2期31卷 132-136页

作者：黄立平刘长明危艳武张朝霞陆月华郭龙军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

以纯化的杆状病毒表达的重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白(PCV2-rCap)免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了5株稳定分泌抗PCV2-rCap蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1D2、2E8、3A10、5F2和6F10。这5株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产... 详细信息

以纯化的杆状病毒表达的重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白(PCV2-rCap)免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了5株稳定分泌抗PCV2-rCap蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1D2、2E8、3A10、5F2和6F10。这5株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价分别为1∶2048000、1∶512000、1∶1024000、1∶512000、1∶1024000;其中1D2、2E8、5F2和6F10单抗亚类为IgG2a,仅3A10为IgG1;2E8、3A10、5F2和6F10单抗轻链为λ型,仅1D2轻链为κ型。Western blot结果显示,这5株单抗中2E8、3A10、5F2和6F10可与自然PCV2-Cap发生反应,而1D2无反应。IPMA和抗原捕获ELISA结果表明,1D2单抗可与PCV2病毒蛋白发生反应,而与PCV1无交叉反应;病毒中和试验证实,1D2单抗具有中和活性,是一株针对PCV2-Cap蛋白中和表位的单抗。这些单抗的制备为PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。

关键词：猪圆环病毒2型重组Cap蛋白中和活性单克隆抗体

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我国部分地区猪圆环病毒2型分离株的遗传变异分析

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中国预防兽医学报 2009年第11期31卷 856-859页

作者：郭龙军陆月华危艳武黄立平刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为了解我国猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株遗传变异情况,本研究对本实验室分离到的19株PCV2分离株通过病毒全基因组克隆和测序分析,将其分为2个大基因群和3个亚群,其基因组分别为1766nt、1767nt和1768nt,各占15.8%、73.7%和10.5%。以1767n... 详细信息

为了解我国猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株遗传变异情况,本研究对本实验室分离到的19株PCV2分离株通过病毒全基因组克隆和测序分析,将其分为2个大基因群和3个亚群,其基因组分别为1766nt、1767nt和1768nt,各占15.8%、73.7%和10.5%。以1767nt毒株为基准,其基因组第39或1039位有1个碱基缺失后突变成1766nt毒株;第1040位有1个碱基插入后突变成1768nt毒株。对19株病毒ORF2编码的Cap蛋白分析发现,有4株病毒编码基因发生了突变,出现了705nt和708nt两种突变型,使ORF2编码的Cap蛋白C末端分别有1和2个氨基酸增加。同时,本实验选用AccⅠ和FbaⅠ内切酶对19株病毒基因组PCR产物进行了限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析,其结果可作为流行毒株分型鉴别依据。

关键词：猪圆环病毒2型流行毒株遗传变异限制性片段长度多态性

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抗鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体制备与鉴定

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中国预防兽医学报 2009年第8期31卷 654-656页

作者：于丹韩宗玺邵昱昊李慧昕金鑫孔宪刚刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 延边大学农学院吉林延边134000

为建立抗鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的单克隆抗体(MAb),利用浓缩的IBV致弱株CK/CH/LDL97ⅠF115病毒免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,经间接ELISA和有限稀释法,经筛选和克隆后获得了一株抗IBV N蛋白MAb的杂交瘤细胞系(2D2)。经鉴定,其MAb... 详细信息

为建立抗鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的单克隆抗体(MAb),利用浓缩的IBV致弱株CK/CH/LDL97ⅠF115病毒免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,经间接ELISA和有限稀释法,经筛选和克隆后获得了一株抗IBV N蛋白MAb的杂交瘤细胞系(2D2)。经鉴定,其MAb的重链为IgG1亚型,轻链为κ链。ELISA和western blot试验结果表明,所获得的这株2D2 MAb可特异性识别IBV N蛋白。2D2 MAb可与多种血清型IBV发生反应,表明该MAb识别的表位可能位于N蛋白的保守区域。为进一步鉴定IBV的表位及诊断试剂的研究奠定了基础。

关键词：传染性支气管炎病毒 N蛋白单克隆抗体

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猪繁殖与呼吸综合征病毒反转录环媒恒温检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2009年第5期31卷 378-382页

作者：陈长木崔尚金张超范鄢明华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150000 天津农业科学院畜牧兽医研究所天津300112

本研究利用PrimerExplorer V4软件设计了针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N基因保守区6个特异性部位的4种引物,建立了PRRSV的反转录环媒恒温检测方法。利用该方法所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用1 h即可得到其特有的阶梯状条带,... 详细信息

本研究利用PrimerExplorer V4软件设计了针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N基因保守区6个特异性部位的4种引物,建立了PRRSV的反转录环媒恒温检测方法。利用该方法所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用1 h即可得到其特有的阶梯状条带,而且猪细小病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和健康猪睾丸细胞的扩增结果均为阴性。本方法对PRRSV的最低检出量为1×100个～1×101个基因拷贝。反转录环媒恒温检测方法和普通RT-PCR方法检测临床样品的符合率为96.2%。该方法为现地开展猪繁殖与呼吸综合征的快速诊断和综合防治方案的提出提供了有力的诊断工具。

关键词： PRRSV 环媒恒温检测方法

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带BAC质粒的重组伪狂犬病毒的构建及其体外生长特性研究

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中国预防兽医学报 2009年第1期31卷 10-15页

作者：彭金美王瑜田志军周艳君陈瑾安同庆童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 华中农业大学湖北武汉430070 中国农业科学院上海兽医研究所上海200232

本研究通过基因克隆技术以伪狂犬病病毒(PRV)弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源重组序列,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,构建了带LoxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒,将pBeloBACII线性化后插入到pUCTKAB-EGFP中构建了转移载... 详细信息

本研究通过基因克隆技术以伪狂犬病病毒(PRV)弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源重组序列,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,构建了带LoxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒,将pBeloBACII线性化后插入到pUCTKAB-EGFP中构建了转移载体pUCTK-EGFP-BACII。将PRV基因组和转移载体共转染Vero细胞,利用同源重组在Bartha K61株的TK基因中插入了BAC质粒和绿色荧光蛋白筛选标记,经过11轮噬斑纯化和鉴定证实获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC。通过噬斑试验和一步生长曲线测定等方法对重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC的生长特性进行研究,结果发现带有BAC质粒及筛选标记的重组病毒rv-PRVBAC在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒Bartha K61株相比没有明显差别,说明大的基因片段的插入没有影响重组病毒在体外的繁殖速度。重组病毒rv-PRVBAC在Vero细胞上盲传18代,其绿色荧光蛋白仍能够稳定表达,通过PCR鉴定可以检测到插入的外源片段和插入位点两侧的病毒基因序列,表明所获得的重组病毒rv-PRVBAC得到了稳定遗传。本研究成功获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC,为进一步开展PRV的细菌人工染色体的构建奠定了基础。

关键词：伪狂犬病毒 Bartha K61株 BAC 重组病毒

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不同宿主源NDV毒株对SPF鸡致病性研究

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中国预防兽医学报 2009年第2期31卷 99-103,109页

作者：刘怀然孙敏华葛鑫刘胜旺刘培欣孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为阐明不同宿主及不同基因型新城疫病毒(NDV)对SPF鸡致病性,选择分离自鸡、番鸭、鹅、健康野鸟的基因Ⅶd亚型NDV6株,鸡源基因Ⅲ型和鸽源基因Ⅵb型毒株各1株,以及基因Ⅸ型强毒F48E9,共9株NDV毒株进行致病性试验。在对各毒株的EID50及主... 详细信息

为阐明不同宿主及不同基因型新城疫病毒(NDV)对SPF鸡致病性,选择分离自鸡、番鸭、鹅、健康野鸟的基因Ⅶd亚型NDV6株,鸡源基因Ⅲ型和鸽源基因Ⅵb型毒株各1株,以及基因Ⅸ型强毒F48E9,共9株NDV毒株进行致病性试验。在对各毒株的EID50及主要致病指数MDT、ICPI测定基础之上,以相同剂量感染15日龄SPF鸡,观察临床症状及剖检病变,计算发病率和死亡率,并在攻毒后不同时间采集主要组织样品,以SYBR GreenI Real-timePCR检测病毒最早出现时间及病毒载量。结果表明,6株基因Ⅶd亚型NDV毒株导致SPF鸡100%发病,死亡率90%以上,属于高致病性毒株;基因Ⅲ、Ⅵb型毒株导致SPF鸡发病但不死亡,属于中等毒力毒株。Ⅶd亚型毒株与F48E9株攻毒后SPF鸡在病理变化、组织嗜性及病毒载量上没有显著差异。根据毒株的MDT、ICPI指数及攻毒鸡病程综合判断,Ⅶd亚型毒株在致病性上与F48E9株差异不显著。健康野鸟携带基因Ⅶd亚型高致病性NDV,在NDV的自然生态传播过程中起重要作用,提示应该加强对野鸟的流行病学监测及相关研究。

关键词：新城疫病毒基因型致病性病毒载量

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基因修饰的鸡新城疫病毒HN基因DNA疫苗免疫效力评价

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畜牧兽医学报 2009年第10期40卷 1526-1531页

作者：石星明贺笋王玫杨桂花曾伟伟崔红玉童光志王云峰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室哈尔滨150001 河北北方学院动物科技学院动物医学系张家口075131 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为了评价基因修饰对提高DNA疫苗免疫效果的影响,将NDV F48E9株HN基因进行密码子优化和信号肽替换,修饰后的基因命名为SoptiHN,将HN和SoptiHN基因分别克隆至pVAX 1和含CpG-ODN刺激序列的载体pVAX 1-CpG中,共获得pV-SoptiHN、pVC-SoptiHN... 详细信息

为了评价基因修饰对提高DNA疫苗免疫效果的影响,将NDV F48E9株HN基因进行密码子优化和信号肽替换,修饰后的基因命名为SoptiHN,将HN和SoptiHN基因分别克隆至pVAX 1和含CpG-ODN刺激序列的载体pVAX 1-CpG中,共获得pV-SoptiHN、pVC-SoptiHN、pV-HN和pVC-HN 4种质粒。将4种质粒股四头肌多点注射3周龄SPF鸡,每只鸡200μg,以PBS为非免疫对照;一免后3周以相同的剂量加强免疫,二免后2周以103EID50NDV的F48E9强毒株进行攻毒,计算发病率、死亡率以及排毒情况。试验期间每周采集血清进行HI抗体的检测,同时采集抗凝血分离外周血淋巴细胞,分析免疫后各试验组IFN-γ和IL-18的变化情况。结果表明,疫苗免疫1周后,所有免疫组均能产生抗NDV的HI抗体,pV-SoptiHN和pVC-SoptiHN组最高,与其他组差异显著;pVC-SoptiHN和pVC-HN质粒免疫组IFN-γ和IL-18表达水平要略高于pV-SoptiHN和pV-HN质粒免疫组。攻毒结果显示,pV-SoptiHN与pVC-SoptiHN免疫组的死亡保护率均为71%,排毒检出率均为25%,而pV-HN和pVC-HN免疫组的保护率均为50%,排毒检出率分别为50%和44%,pVAX1、pVAX1-CpG和PBS对照组攻毒后的死亡率均为100%,排毒检出率均为100%,pV-SoptiHN与pVC-SoptiHN免疫组的排毒时间与其他5组相比有所缩短。以上结果表明,修饰后的HN基因可以诱导鸡产生更强烈的免疫反应,获得更好的保护效率。

关键词：基因修饰 NDV DNA疫苗免疫保护

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表达传染性支气管炎S1基因和IFN-γ基因重组鸡痘病毒安全性与最适免疫剂量分析

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畜牧兽医学报 2009年第5期40卷 712-716页

作者：石星明王云峰王玫兰德松任刚李继松曾伟伟孙妍刘胜旺童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室哈尔滨150001 东莞出入境检验检疫局东莞523071 中国农业科学院上海兽医研究所上海200232

对共表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因和II型干扰素基因的重组鸡痘病毒（rFPV-IFNγS1）冻干疫苗进行安全性和最适免疫剂量的研究。取冻干疫苗，加生理盐水恢复至冻干前体积，分别取0.1 mL经翅内侧无血管处皮下接种1周龄SPF鸡，接种剂量... 详细信息

对共表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因和II型干扰素基因的重组鸡痘病毒（rFPV-IFNγS1）冻干疫苗进行安全性和最适免疫剂量的研究。取冻干疫苗，加生理盐水恢复至冻干前体积，分别取0.1 mL经翅内侧无血管处皮下接种1周龄SPF鸡，接种剂量为1.0×10^5PFU，接种后3 d出现局部反应，5 d局部肿胀达到最大，接种鸡无其它全身反应，精神、食欲以及发育等均不受影响，说明重组病毒对实验鸡是安全的。将重组疫苗用生理盐水作倍比稀释后翅内侧无血管处皮下接种4周龄SPF鸡，接种剂量为1.0×10^1-1.0×10^4PFU，免疫后3周攻击传染性支气管炎病毒LX4株。结果表明，在接种剂量为1.0×10^2-1.0×10^4PFU的剂量范围内均可以使全部实验鸡产生局部反应，并对IBV的攻击形成保护，降低免疫鸡的发病率和死亡率，发病保护率达到73%以上；1.0×10^1PFU接种实验鸡后，仅有5/11的鸡出现局部反应，对IBV攻击的发病保护率为64%，与对照组差异不显著（P〉0.05）。以上结果说明，疫苗接种后的局部反应与重组疫苗的免疫效力之间具有相关性，根据疫苗生产使用实际情况确定传染性支气管炎重组鸡痘病毒疫苗的最适免疫剂量为10^3PFU。

关键词：传染性支气管炎重组鸡痘病毒 S1基因最适免疫剂量

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重组鸡β-防御素6基因的表达和生物学特性的研究

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中国预防兽医学报 2009年第6期31卷 476-480页

作者：韩宗玺廖文艳王瑞琴邵昱昊马得莹中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物营养研究所黑龙江哈尔滨150030

从鸡骨髓细胞中分离提取总RNA,经过RT-PCR扩增出鸡β-防御素-6(AvBD6)基因。经克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为204bp,编码68个氨基酸残基。根据已发现的禽β-防御素和鼠β-防御素-6的氨基酸序列构建系统进化树。发现鸡AvBD6氨基酸序... 详细信息

从鸡骨髓细胞中分离提取总RNA,经过RT-PCR扩增出鸡β-防御素-6(AvBD6)基因。经克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为204bp,编码68个氨基酸残基。根据已发现的禽β-防御素和鼠β-防御素-6的氨基酸序列构建系统进化树。发现鸡AvBD6氨基酸序列与鸡AvBD7氨基酸序列同源性最高,为62.7%。将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,进行原核表达。SDS-PAGE电泳表明,表达的重组鸡AvBD6融合蛋白分子量约为32ku。对该重组蛋白进行纯化与体外抗菌活性的测定。结果表明,重组鸡AvBD6融合蛋白对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌有较高抗菌活性,对大肠杆菌的抗菌活性较弱,对猪霍乱沙门氏菌无抗菌活性。重组鸡AvBD6蛋白对上述细菌的最小抑菌浓度范围为31.25μg/mL～250μg/mL。此外,重组鸡AvBD6蛋白对温度和酸碱度有较高的稳定性。

关键词：鸡β-防御素-6 遗传进化抗菌活性

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