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畜牧兽医学报 2008年第10期39卷 1426-1431页

作者：韩宗玺马得莹刘胜旺李一经中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001 东北农业大学动物营养研究所哈尔滨150030 东北农业大学动物医学院哈尔滨150030

采用RT-PCR方法,从鸡舌组织中扩增到Gallinacin-9(Gal-9)基因,测序表明Gal-9为201 bp,其成熟肽由67个氨基酸残基组成。进一步将克隆的Gal-9基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1的EcoRⅠ和SalⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pGEX... 详细信息

采用RT-PCR方法,从鸡舌组织中扩增到Gallinacin-9(Gal-9)基因,测序表明Gal-9为201 bp,其成熟肽由67个氨基酸残基组成。进一步将克隆的Gal-9基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1的EcoRⅠ和SalⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pGEX-Gal-9,经序列分析鉴定确证目的基因克隆入载体的预期位点。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,于37℃诱导培养不同时间,SDS-PAGE电泳表明该基因在大肠杆菌中高水平表达,表达的重组鸡Gal-9融合蛋白相对分子质量约为32 ku。重组蛋白占菌体总蛋白的40%。表达的重组鸡Gal-9融合蛋白以包涵体的形式存在。重组蛋白经纯化后,分别以对数生长中期的大肠杆菌BL21(DE3-)株与致病性链球菌CAB株为检测菌,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组Gal-9蛋白的抗菌活性,结果表明,重组Gal-9对这2种细菌都具有抗菌活性。

关键词： Gallinacins-9 鸡融合蛋白抗菌活性

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重组鸡β-防御素10蛋白的原核表达及其抗菌活性的测定

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中国预防兽医学报 2008年第10期30卷 765-769,789页

作者：廖文艳马得莹韩宗玺刘胜旺东北农业大学动物营养研究所黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

鸡抗菌肽属β-防御素类,在鸡的先天性免疫中发挥重要作用。本研究将克隆得到的鸡β-防御素-10基因(AvBD10)亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中构建了重组表达质粒pGEX-AvBD10。将重组质粒转化至BL21,于37℃用IPTG诱导培养不同时间,SDS-PAG... 详细信息

鸡抗菌肽属β-防御素类,在鸡的先天性免疫中发挥重要作用。本研究将克隆得到的鸡β-防御素-10基因(AvBD10)亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中构建了重组表达质粒pGEX-AvBD10。将重组质粒转化至BL21,于37℃用IPTG诱导培养不同时间,SDS-PAGE电泳与灰度扫描显示该重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34.3%。表达的AvBD10融合蛋白以包涵体的形式存在,分子量约为31ku。重组蛋白经纯化后,以对数生长中期的大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌和猪霍乱沙门氏菌为检测菌,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组鸡AvBD10蛋白的抗菌活性。结果显示,重组鸡AvBD10蛋白对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌有抗菌活性。此外,重组鸡AvBD10蛋白在-70℃～100℃及在pH4～pH10条件下仍具有抗菌活性。

关键词：鸡AvBD10 融合蛋白抗菌活性

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新城疫病毒样颗粒(ND-VLPs)免疫效力的研究

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中国预防兽医学报 2008年第1期30卷 42-46,63页

作者：吴芬芳闫丽辉曹殿军刘培欣闻晓波孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

为了研究ND-VLPs的免疫原性,利用共表达NDV F、HN、NP和M蛋白的重组杆状病毒rBac-F-HN-NP-M感染Sf9细胞,采用蔗糖密度梯度离心法纯化释放到细胞培养上清的VLPs,免疫60只,18日龄SPF鸡,监测血清中NDV特异性抗体滴度的变化。2周后用相同剂... 详细信息

为了研究ND-VLPs的免疫原性,利用共表达NDV F、HN、NP和M蛋白的重组杆状病毒rBac-F-HN-NP-M感染Sf9细胞,采用蔗糖密度梯度离心法纯化释放到细胞培养上清的VLPs,免疫60只,18日龄SPF鸡,监测血清中NDV特异性抗体滴度的变化。2周后用相同剂量的VLPs加强免疫。二免后2周以3.16×103EID50的F48E9株强毒滴鼻攻毒。攻毒前,LaSota灭活苗、LaSota+20μgVLP和不同剂量VLPs组(10μg、20μg、25μg)HI效价分别为28.3、28.9、24.1、26.1、26.7;攻毒后,10μg和20μgVLP免疫组仅能提供了80%和90%的保护率,但与LaSota灭活苗、LaSota+20μgVLP一样,25μgVLP试验组却能够完全抵抗致死剂量的NDV强毒攻击。本试验表明,ND-VLPs具有良好的免疫原性,25μgVLP诱导机体产生的免疫应答能抵抗致死剂量强毒的攻击。ND-VLPs有可能用来研制针对新城疫流行变异株的高效疫苗。

关键词：新城疫病毒病毒样颗粒免疫原性免疫效力

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传染性喉气管炎病毒WG株Us区基因结构分析

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中国预防兽医学报 2008年第10期30卷 779-784页

作者：韩文雄石星明王云峰兰德松胡文玮王玫曹贵方童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018 中国农业科学院上海兽医研究所上海200232

根据GenBank中的传染性喉气管炎病毒(ILTV)全序列(NCBI登录号:NC-006623),利用Oligo6.2分析序列并设计6对引物,以ILTVWG株基因组DNA为模板,PCR扩增了长度为13.1kb的区域,得到了完整的WG株的Us区序列,初步鉴定了WG株的Us区基因结构。将W... 详细信息

根据GenBank中的传染性喉气管炎病毒(ILTV)全序列(NCBI登录号:NC-006623),利用Oligo6.2分析序列并设计6对引物,以ILTVWG株基因组DNA为模板,PCR扩增了长度为13.1kb的区域,得到了完整的WG株的Us区序列,初步鉴定了WG株的Us区基因结构。将WG株的Us区序列分别与ILTVUSDA株、BHV-1、CeHV-1、EHV-1、HSV-1、HSV-2、MDV、PrV、HVT、VZV相比较,ILTVWG株与USDA株同源性为99.2%,而与其他疱疹病毒之间的同源性较低,而且Us区大小也不一致;与已发表的ILTVUSDA株Us区基因序列分别比较后发现,两者之间差异较大的基因分别为gJ基因和gD基因。其中,gJ基因在第1983个碱基处比USDA株多出30bp,DNAStar预测这30bp可能形成一个独立的抗原表位;gD基因的长度在不同的ILTV毒株之间差别较大,与其他疱疹病毒具有相似的结构特征。

关键词：传染性喉气管炎病毒 WG株 Us区基因序列分析

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猪繁殖与呼吸综合征病毒Taq Man-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用

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中国预防兽医学报 2008年第12期30卷 944-948,991页

作者：韦天超田志军安同庆周艳君肖燕姜一峰郝晓芳张善瑞彭金美仇华吉童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 广西大学动物科学技术学院广西南宁530005 中国农业科学院上海兽医研究所上海200232

本研究设计针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因的特异性引物和Taq Man荧光探针,建立了一种检测PRRSV的快速、敏感、特异和重复性好的Taq Man荧光定量RT-PCR方法。该方法在检测101拷贝/μL～107拷贝/μL模板范围内具有良好的线... 详细信息

本研究设计针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因的特异性引物和Taq Man荧光探针,建立了一种检测PRRSV的快速、敏感、特异和重复性好的Taq Man荧光定量RT-PCR方法。该方法在检测101拷贝/μL～107拷贝/μL模板范围内具有良好的线性关系,比常规RT-PCR更敏感,可分别检测?

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量RT-PCR 病毒含量

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实时荧光定量RT-PCR检测ICP4、IFN-γ和IL-18基因在ILTV感染鸡三叉神经节中的表达

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中国兽医学报 2008年第10期28卷 1150-1153,1166页

作者：木古丽王云峰石星明童光志何来王玫中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

将20只4月龄SPF鸡人工感染传染性喉气管炎病毒(ILTV)WG株,于感染后39d翅静脉和肌肉注射地塞米松(DEX),感染后5、9、10、11、12、39d及DEX处理后1、2、3、5、6、7、8d采喉拭子,检测病毒DNA,并于感染前和感染后6、10、20、31d及DEX处理后2... 详细信息

将20只4月龄SPF鸡人工感染传染性喉气管炎病毒(ILTV)WG株,于感染后39d翅静脉和肌肉注射地塞米松(DEX),感染后5、9、10、11、12、39d及DEX处理后1、2、3、5、6、7、8d采喉拭子,检测病毒DNA,并于感染前和感染后6、10、20、31d及DEX处理后2、4、7、10、30d每组各取1只鸡颈静脉放血致死后无菌采集三叉神经节,提总RNA后利用real-timeRT-PCR的方法定量检测ICP4、IFN-γ和IL-18特异性mRNA。结果表明,在人工感染后处于潜伏状态的病毒能再被激活,并且ICP4基因在病毒还未被激活时就能低水平表达,这种低水平的立即早期(IE)基因的表达能提供持续的抗原刺激来维持神经节中的炎性细胞分泌IFN-γ和IL-18,以至于维持病毒处于潜伏状态而不致激活后感染其他的健康宿主;DEX处理后2d,IFN-γ的表达达到峰值,对病毒的再激活起抑制作用,尽管DEX处理前后IL-18的表达量没有明显变化,推测当潜伏的病毒一旦被激活时,IFN-γ可协同IL-18起到抑制IL-TV的作用。

关键词：传染性喉气管炎病毒地塞米松(DEX) 基因表达定量分析实时荧光定量RT—PCR 鸡

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PCV2 PPV PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

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中国兽医科学 2008年第8期38卷 691-696页

作者：岳丰雄崔尚金冉多良张超范中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段。通过对反应因素进行优化,建立... 详细信息

参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段。通过对反应因素进行优化,建立了检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法。敏感性和特异性结果显示,该mPCR对4种病毒的最低核酸检测量分别为29.0 pg(PCV2)、17.3 pg(PPV)、36.8 pg(PRRSV)、38.4 pg(PRV),而对猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒1型、牛病毒性腹泻黏膜病病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。119份临床样品的多重PCR检测结果显示,有3份样品同时感染PPV和PCV2,68份样品同时感染PRRSV和PCV2,其余样品均为PCV2阳性。表明,建立的多重PCR方法能够对PCV2、PPV、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。

关键词：猪圆环病毒2型猪细小病毒猪伪狂犬病病毒猪生殖与呼吸综合征病毒多重PCR

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PRRSV和PCV-2以及PRV多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2008年第6期38卷 494-499页

作者：王小武符芳柴政孔令达蔡雪辉宋淑萍许红喜李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆163319

根据GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因、猪圆环病毒2型(PCV-2)rep蛋白基因和猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的核苷酸序列分别设计了3对特异性引物,成功建立了同时检测PRRSV、PCV-2、PRV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PC... 详细信息

根据GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因、猪圆环病毒2型(PCV-2)rep蛋白基因和猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的核苷酸序列分别设计了3对特异性引物,成功建立了同时检测PRRSV、PCV-2、PRV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR方法。敏感性试验结果显示,PRRSV、PCV-2的敏感性可达250拷贝/μL,PRV的敏感性可达500拷贝/μL。表明,该方法具有较好的特异性、重复性和敏感性,可以用于PRRSV、PCV-2和PRV的快速检测。

关键词：猪生殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型猪伪狂犬病病毒多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光 PCR

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抗菌肽CAP18在大肠杆菌中表达、纯化及活性的初步鉴定

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中国预防兽医学报 2008年第11期30卷 861-865页

作者：徐灵龙石星明王云峰史春林王玫孙妍童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院上海兽医研究所上海200232

根据抗菌肽CAP18活性片段的氨基酸序列,采用SOE技术,设计合成了CAP18的编码基因,将其克隆至pMD18-T载体,进行序列测定后亚克隆至pET-32a(+)表达载体中,在*** BL21(DE3)中表达融合蛋白CAP18。经Ni2+亲和层析后回收CAP18融合蛋白,纯度达到... 详细信息

根据抗菌肽CAP18活性片段的氨基酸序列,采用SOE技术,设计合成了CAP18的编码基因,将其克隆至pMD18-T载体,进行序列测定后亚克隆至pET-32a(+)表达载体中,在*** BL21(DE3)中表达融合蛋白CAP18。经Ni2+亲和层析后回收CAP18融合蛋白,纯度达到了85%以上。对纯化的融合蛋白进行酶切,用液体生长抑制方法检测切割后样品的活性,结果表明重组抗菌肽CAP18对大肠杆菌具有抑制活性。

关键词：兔抗菌肽CAP18 融合基因重组表达抑菌活性

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鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/LSD/05Ⅰ的分离、鉴定及弱毒疫苗对气管的保护

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农业生物技术学报 2008年第6期16卷 911-919页

作者：王钰李成仁张晓楠韩宗玺邵昱昊刘胜旺孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室东北农业大学黑龙江八一农垦大学

从2005~2006年中国部分地区鸡场疑似鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus)感染鸡分离到12株鸡传染性支气管炎病毒,并对其部分生物学特性及基因型进行了研究。发现其中11株病毒分属于LX4和CK/CH/LSC/99Ⅰ型。通过S1... 详细信息

从2005~2006年中国部分地区鸡场疑似鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus)感染鸡分离到12株鸡传染性支气管炎病毒,并对其部分生物学特性及基因型进行了研究。发现其中11株病毒分属于LX4和CK/CH/LSC/99Ⅰ型。通过S1基因比较、进化树分析、BLAST搜寻和动物试验研究发现,CK/CH/LSD/05Ⅰ是一株新型变异毒株。动物感染试验表明,CK/CH/LSD/05Ⅰ感染鸡的肾脏病变不明显,仅有20%的感染鸡肾脏病毒分离呈阳性,但100%感染鸡呼吸道病毒分离阳性,表明该病毒不是中国普遍流行的肾型毒株,而其对呼吸道具有较强嗜性。同时,实验应用弱毒疫苗H120和本实验室致弱的3株异种毒株进行了动物保护试验,结果显示,用CK/CH/LSD/05Ⅰ攻毒后,这4株异种传染性支气管炎病毒的免疫对气管的保护率很低。初步揭示该毒株可能属新的血清型病毒。

关键词：传染性支气管炎病毒纤突蛋白变异株组织嗜性

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