检索结果-内蒙古大学图书馆

猪急性腹泻综合征冠状病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用

畜牧兽医学报 2021年第10期52卷 2887-2894页

作者：张记宇韩郁茹时洪艳陈建飞张鑫刘建波张燎原冯书风冯廷帅季朝阳石达冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪消化道传染病创新团队哈尔滨150069

为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品... 详细信息

为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×10^(1)~3.31×10^(7)拷贝·μL^(-1)模板量时,呈良好的线性关系,相关系数(R2)为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×10^(1)拷贝·μL^(-1),组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12~36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为10^(6.7)、10^(5.3)拷贝·mL^(-1)。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。

关键词：猪急性腹泻综合征病毒 N基因荧光定量PCR 检测

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NLRP1炎性小体的激活机制

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畜牧兽医学报 2023年第2期54卷 494-503页

作者：何豪杰薛美冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪消化道传染病创新团队哈尔滨150069

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1(NLRP1)是NOD样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族的成员,是人们发现的第一个能形成炎性小体的蛋白。NLRP1的激活可引起半胱氨酸蛋白酶-1前体(pro-caspase-1)的活化并进一步促进炎性因子的成熟和释放,在天然免疫中发挥着重要作用。NLRP1的结构在不同种属间存在差异,目前能引起NLRP1激活的机制,主要包括通过蛋白酶体途径降解并激活NLRP1、通过抑制DPP9激活NLRP1以及弓形虫和部分代谢抑制剂激活NLRP1等。某些病毒蛋白或RNA也能够激活NLRP1,其具体激活机制以及NLRP1在抗病毒感染中发挥的作用尚未明确,还有待于进一步研究。

关键词： NLRP1 炎性小体病毒激活机制

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猪丁型冠状病毒S1-CTD相互作用宿主蛋白的筛选和鉴定

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畜牧兽医学报 2022年第7期53卷 2260-2267页

作者：汤荣锋范前进郭龙军张鑫石达时洪艳陈建飞冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪消化道传染病创新团队哈尔滨150069

猪丁型冠状病毒纤突蛋白S1亚基C端结合域(S1-CTD)是诱导中和抗体产生的主要区域,为研究与其相互作用的宿主蛋白,采用HEK-293T真核表达系统表达并纯化了S1-CTD,提取了猪回肠上皮细胞膜蛋白,通过免疫共沉淀筛选了可能与S1-CTD相互作用的... 详细信息

猪丁型冠状病毒纤突蛋白S1亚基C端结合域(S1-CTD)是诱导中和抗体产生的主要区域,为研究与其相互作用的宿主蛋白,采用HEK-293T真核表达系统表达并纯化了S1-CTD,提取了猪回肠上皮细胞膜蛋白,通过免疫共沉淀筛选了可能与S1-CTD相互作用的蛋白并进行质谱分析,发现32个疑似相互作用的宿主蛋白。构建其中可能与S1-CTD互作的蛋白KIF1 binding protein(KIFBP)的真核表达质粒,通过免疫共沉淀和激光共聚焦验证上述宿主蛋白与S1-CTD是否存在相互作用,结果表明KIFBP和S1-CTD之间存在相互作用,共同转染时在细胞质共定位。进一步研究表明,过表达KIFBP能够有效降低病毒RNA水平和病毒滴度,其中mRNA水平降低了约70%,病毒滴度降低了10^(1.6)TCID_(50)。综上,本研究筛选并鉴定出一种与PDCoV S1-CTD相互作用的宿主蛋白KIFBP,为了解PDCoV的致病机制提供了理论基础。

关键词：猪丁型冠状病毒 S1-CTD蛋白相互作用 KIFBP

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2005年-2010年我国部分地区PRRSV流行毒株的遗传变异分析

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动物医学进展 2011年第3期32卷 1-7页

作者：范培虎危艳武郭龙军吴洪丽黄立平刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为了掌握高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的变异情况,揭示该病的发生规律,根据GenBank登录的PRRSV基因序列设计引物,采用RT-PCR法对2005年-2010年间送检的282份病料进行了PRRSV核酸检测,对其中9份阳性样品进行了ORF5-7基因片... 详细信息

为了掌握高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的变异情况,揭示该病的发生规律,根据GenBank登录的PRRSV基因序列设计引物,采用RT-PCR法对2005年-2010年间送检的282份病料进行了PRRSV核酸检测,对其中9份阳性样品进行了ORF5-7基因片段扩增和测序,所得序列与GenBank下载的PRRSV CH-1a、VR2332、HB-2、LV株的ORF5序列进行同源性比较,并与国内已发表的27株PRRSV ORF5序列进行遗传进化树分析,对GP5蛋白潜在糖基化位点和数目进行预测与分析。结果表明,病料PRRSV核酸阳性检出率为18.8%（53/282）;9个流行毒株同属于一个基因亚群,其ORF5序列同源性为95.0%-99.2%,氨基酸序列同源性为92.0%-99.0%;与4个参考毒株的ORF5序列同源性依次为93.4%-95.5%、87.6%-89.4%、91.2%-92.7%和63.0%-64.0%,氨基酸序列的同源性依次为91.0%-94.0%、85.6%-88.6%、89.6%-92.0%和54.7%-58.2%;GP5糖基化位点分析表明,5个糖基化位点有3株,4个糖基化位点有5株,3个糖基化位点有1株;这些糖基化位点分布在第30位-第55位氨基酸之间,以第44、55位点保守,另3个位点存在变异。我国猪群中PRRSV流行毒株变异幅度较大,GP5糖基化位点不同可能与毒力存在一定联系。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5基因遗传变异

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猪细小病毒体外培养适应毒株的培育及动物感染试验

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动物医学进展 2012年第11期33卷 1-7页

作者：李胜斌危艳武唐青海吴洪丽刘建波郭龙军王一平刘丹刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

从初产母猪流产胎儿的肠系膜淋巴结中分离到一株猪细小病毒(PPV),采用无污染的猪睾丸传代细胞系(ST)对该毒株传代,培育成一株细胞适应毒株,命名为PPV-HJ毒株。该毒株经ST细胞连续传50代,于第25代起毒价显著提升,第40代毒价维持稳定(107.... 详细信息

从初产母猪流产胎儿的肠系膜淋巴结中分离到一株猪细小病毒(PPV),采用无污染的猪睾丸传代细胞系(ST)对该毒株传代,培育成一株细胞适应毒株,命名为PPV-HJ毒株。该毒株经ST细胞连续传50代,于第25代起毒价显著提升,第40代毒价维持稳定(107.2 TCID50/mL)。用免疫过氧化物酶单层细胞染色试验(IPMA)检测表明,病毒感染的阳性细胞染成棕红色,病毒抗原主要分布在细胞核中。免疫电镜观察到PPV粒子呈球状,直径约21nm。基因克隆测序证实,该毒株的NS1基因序列与GenBank中PPV-ZJ毒株同源性最高,达98.41%。用该毒株第50代培养物(1×107.2 TCID50/mL)接种35日龄仔猪,未表现出明显的临床症状,剖检未观察到明显的病理学变化,PCR法在猪的肺脏、扁桃体、腹股沟淋巴结、下颌淋巴结、小肠中检测到病毒核酸,表明该毒株对易感动物具有一定的感染性。本研究成功地培育出一株PPV体外细胞培养适应毒株,其繁殖性能稳定,为今后开展PPV与猪圆环病毒2型(PCV-2)混合感染的协同致病性研究,以及联合疫苗的研制奠定了基础。

关键词：猪细小病毒分离鉴定毒株培育

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2009年我国部分地区禽白血病分子流行病学调查

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中国预防兽医学报 2010年第1期32卷 32-35,43页

作者：高玉龙邵华斌罗青平潘伟秦立廷孙芬芬刘超男高宏雷祁小乐王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所湖北武汉430065

为了解自2009年年初以来国内一些地区禽白血病流行情况及流行毒株的分子特征,我们从湖北、黑龙江、山东、辽宁、吉林、广东、宁夏、安徽8个省区39个鸡场采集疑似禽白血病病料样品178份,用ALV-A、ALV-B和ALV-J特异性引物,通过PCR方法进... 详细信息

为了解自2009年年初以来国内一些地区禽白血病流行情况及流行毒株的分子特征,我们从湖北、黑龙江、山东、辽宁、吉林、广东、宁夏、安徽8个省区39个鸡场采集疑似禽白血病病料样品178份,用ALV-A、ALV-B和ALV-J特异性引物,通过PCR方法进行检测。结果表明,8个省的35个鸡场的124份病料中检出了ALV-J(69.7%);25份病料中检出了ALV-A(13.9%);7份病料中检出了ALV-B(3.9%)。14个分离毒株env基因氨基酸同源性为84.3%～99%;与J亚群原型毒株HPRS-103的氨基酸序列同源性为87.3%～98.2%;与其它J亚群env基因氨基酸序列同源性为83%～97.4%。遗传进化分析表明,14个ALV-J分离株分别分属于不同的分支。其中,LJL09DH02分离株与其它分离株及参考毒株的的亲缘关系最远,与HPRS-103的氨基酸同源性仅为87.3%。另外4个分离株的env基因与HPRS-103的氨基酸同源性低于93%,其余9株与HPRS-103的同源性较高(96.6%以上)。该调查结果表明,我国目前ALV的感染主要以J亚群为主,ALV-A和B同时存在。

关键词：禽白血病 J亚群白血病血管瘤 env基因分子流行病学

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应用Gelatin和3D培养验证细胞粘附对传染性支气管炎病毒在体外培养细胞中增殖的影响

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中国预防兽医学报 2018年第12期40卷 1089-1094页

作者：王娜娜韩宗玺山丹邵昱昊刘胜旺李海中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道传染病创新团队黑龙江哈尔滨150069

除传染性支气管炎病毒(IBV) Beaudette株外,其它IBV均难以在体外细胞系中传代培养。为研究限制IBV体外传代培养的影响因素,本研究应用流式细胞术检测IBV经典株M41囊膜与宿主细胞膜融合程度,结果显示M41可以在体外培养条件下侵入鸡细胞系... 详细信息

除传染性支气管炎病毒(IBV) Beaudette株外,其它IBV均难以在体外细胞系中传代培养。为研究限制IBV体外传代培养的影响因素,本研究应用流式细胞术检测IBV经典株M41囊膜与宿主细胞膜融合程度,结果显示M41可以在体外培养条件下侵入鸡细胞系LMH和DF-1,但荧光定量PCR检测显示侵入的M41无法增殖。进一步通过对比分析M41易感组织气管、非易感组织脾脏及LMH细胞全基因组转录谱数据,结果显示宿主细胞粘附、细胞周期、p53及SRC可能是M41在体外培养细胞中增殖的宿主决定因素。本研究通过在2D培养体系中预先孵育Gelatin和3D培养两种方式来调节细胞粘附的物理环境,结果显示两种方法均可以促进M41在体外培养细胞中的增殖;利用多种经典的细胞周期抑制剂及p53和SRC活性调控分子预先处理LMH和DF1,显示细胞周期、p53活性及SRC活性对IBV体外增殖无显著影响。表明细胞粘附特性是影响IBV体外增殖的重要因素。本研究为IBV体外细胞培养体系的建立奠定了实验基础。

关键词：传染性支气管炎病毒全基因组转录谱分析病毒增殖 3D细胞培养

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基于牛呼吸道合胞体病毒融合前F蛋白的间接ELISA方法的建立与应用

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中国预防兽医学报 2019年第11期41卷 1126-1130,1158页

作者：王磊常继涛于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队

为确定牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)在我国的流行情况,本研究以BRSV融合前F蛋白作为包被抗原,经各项条件优化后建立了检测BRSV抗体的间接ELISA方法:确定抗原最佳包被浓度为2 mg/L、待检血清的最佳稀释度为1∶100、最佳封闭液为3%明胶、羊抗... 详细信息

为确定牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)在我国的流行情况,本研究以BRSV融合前F蛋白作为包被抗原,经各项条件优化后建立了检测BRSV抗体的间接ELISA方法:确定抗原最佳包被浓度为2 mg/L、待检血清的最佳稀释度为1∶100、最佳封闭液为3%明胶、羊抗牛Ig G-HRP的稀释度为1:8000,抗体阴阳性临界值为0.204。特异性试验结果显示,该ELISA方法与阿卡斑病毒(AKAV)、牛轮状病毒(BRV)、蓝舌病病毒(BTV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)以及牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的阳性血清无交叉反应。敏感性试验结果显示,当BRSV阳性血清稀释倍数达1∶6400时仍为阳性结果,表明该方法具有较高的敏感性。重复性试验结果显示,ELISA组内、组间最大变异系数分别为6.80%和8.80%,表明该方法的重复性良好。对195份临床牛血清样品检测结果显示,BRSV抗体阳性率为61.0%;对其中的143份血清同时进行病毒中和试验检测,结果显示二者符合率为89.5%。上述结果表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于牛群中BRSV抗体的检测,为BRSV的血清流行病学调查提供可靠的技术手段。

关键词：牛呼吸道合胞体病毒融合前的F蛋白间接ELISA 抗体检测

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牛病毒性腹泻病毒p80蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

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黑龙江畜牧兽医 2016年第7期 1-4,273页

作者：杨立新朱远茂周跃辉任建乐马磊杨婷薛飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室哈尔滨150001

为了制备牛病毒性腹泻病毒（BVDV）p80蛋白单克隆抗体,试验采用BVDV接种牛肾细胞（MDBK）,提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增出BVDV的p80基因,将其定向克隆到原核表达载体pET30a,得到重组表达质粒pET30a-p80。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE... 详细信息

为了制备牛病毒性腹泻病毒（BVDV）p80蛋白单克隆抗体,试验采用BVDV接种牛肾细胞（MDBK）,提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增出BVDV的p80基因,将其定向克隆到原核表达载体pET30a,得到重组表达质粒pET30a-p80。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）表达菌,挑选单菌落并扩大培养,经IPTG诱导和SDS-PAGE以及Western-blot分析表明重组蛋白p80获得了表达,分子质量约为44ku。同时用浓缩的BVDV培养液免疫6-8周龄的Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。利用纯化的重组蛋白p80作为检测抗原的间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆后对获得的杂交瘤细胞进行间接免疫荧光（IFA）和抗体亚类鉴定及腹水的制备和效价的测定。结果表明：重组p80蛋白具有很好的反应性;获得8株稳定分泌针对BVDVp80蛋白的杂交瘤细胞株,分别为3E3、2A4、8H9、3G3、2B3、3G2、2G2和4A11;8株杂交瘤细胞株接种Balb/c小鼠制备腹水,采用BVDV作为包被原的间接ELISA方法测得其效价为1×10^5-1×10^7;8株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性;8株单克隆抗体的抗体亚类均为IgM/κ。说明制备的重组p80蛋白单克隆抗体可试用于建立检测BVDV抗原的诊断方法。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 RT-PCR p80蛋白免疫印迹试验单克隆抗体 IgM 间接免疫荧光试验

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O型口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建及其鉴定

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中国预防兽医学报 2014年第8期36卷 611-614页

作者：孙超杨德成高荣远周国辉王海伟于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队黑龙江哈尔滨150001

为构建含有海肾萤光素酶(Rluc)报告基因的O型口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子,本研究在前期构建的O型FMDV cDNA感染性克隆的基础上,利用融合PCR的方法,以Rluc报告基因替换FMDV的前导蛋白Lb基因和结构蛋白P1基因,构建含有Rluc报告基因的F... 详细信息

为构建含有海肾萤光素酶(Rluc)报告基因的O型口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子,本研究在前期构建的O型FMDV cDNA感染性克隆的基础上,利用融合PCR的方法,以Rluc报告基因替换FMDV的前导蛋白Lb基因和结构蛋白P1基因,构建含有Rluc报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDVRep。将该复制子质粒线性化后,经体外转录制备复制子全长RNA,转染BHK-21细胞,通过RT-PCR方法和间接免疫荧光试验分别检测该复制子RNA的自主复制能力以及FMDV非结构蛋白3B的表达情况。结果显示,复制子RNA在BHK-21细胞中能够进行自主复制并且能够表达病毒的非结构蛋白。Rluc活性检测结果表明,该复制子RNA在BHK-21细胞中可以高效表达Rluc,在转染后2 h^12 h Rluc活性呈线性递增,进一步反映该复制子具有良好的表达外源基因的能力。O型FMDV亚基因组复制子的构建,为深入研究FMDV的复制和翻译机制奠定了基础。

关键词： O型口蹄疫病毒海肾萤光素酶复制子

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