检索结果-内蒙古大学图书馆

中国动物传染病学报 2021年第3期29卷 64-70页

作者：范前进刘秋歌石达王潇博张家林汤荣锋陈建飞冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪消化道传染病创新团队哈尔滨150069

为制备猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)S蛋白的单克隆抗体,本研究首先优化、合成了PDCoV NH株的S基因,利用PCR方法从中扩增S基因片段,克隆至pAAV-IRES-hrGFP真核表达载体,构建真核表达质粒pAAV-NH-S-Flag,转染至HEK293T细胞中进行表达。采用EZv... 详细信息

为制备猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)S蛋白的单克隆抗体,本研究首先优化、合成了PDCoV NH株的S基因,利用PCR方法从中扩增S基因片段,克隆至pAAV-IRES-hrGFP真核表达载体,构建真核表达质粒pAAV-NH-S-Flag,转染至HEK293T细胞中进行表达。采用EZview Red ANTI-FLAG M2亲和凝胶蛋白纯化试剂盒进行纯化重组蛋白。将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,利用Western blot和IFA鉴定单克隆抗体的特异性。结果显示:筛选获得两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株17C7和23F3,单克隆抗体的亚型均为IgM,腹水效价均为1∶6400;两株单克隆抗体都与S蛋白有良好的反应性,且能够与PDCoV发生特异性反应,而与其他常见的猪腹泻冠状病毒不发生反应。本研究为PDCoV诊断及病毒入侵、感染机制的研究奠定了基础。

关键词：猪德尔塔冠状病毒 S蛋白真核表达单克隆抗体

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鹌鹑β- 防御素10基因的克隆与表达及其体内分布的检测

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中国预防兽医学报 2011年第7期33卷 552-556页

作者：蔺利娟王瑞琴韩宗玺邵昱昊刘胜旺程宝晶孙黎李子瑞马得莹东北农业大学动物营养研究所黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为测定鹌鹑β-防御素10(AvBD10)体外抗菌活性及检测其在鹌鹑脏器组织的分布,本研究应用RT-PCR方法从鹌鹑肺脏组织中扩增到鹌鹑AvBD10,经序列同源性分析,鹌鹑AvBD10与鸡AvBD10的氨基酸序列同源性最高(83.8%)。将该基因亚克隆到表达载体pG... 详细信息

为测定鹌鹑β-防御素10(AvBD10)体外抗菌活性及检测其在鹌鹑脏器组织的分布,本研究应用RT-PCR方法从鹌鹑肺脏组织中扩增到鹌鹑AvBD10,经序列同源性分析,鹌鹑AvBD10与鸡AvBD10的氨基酸序列同源性最高(83.8%)。将该基因亚克隆到表达载体pGEX-6p-1中进行原核表达,SDS-PAGE电泳表明,鹌鹑AvBD10重组蛋白分子量约为31ku。该重组蛋白经纯化后测定其体外抗菌活性,结果显示,鹌鹑AvBD10重组蛋白具有广谱的抗菌活性。采用定量RT-PCR法检测到AvBD10在鹌鹑脏器组织中广泛表达。

关键词：鹌鹑 AvBD10 重组蛋白抗菌活性组织分布

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雀形目野生鸟类REV感染状况的调查及分离株gp90基因序列分析

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中国兽医学报 2014年第7期34卷 1078-1082,1113页

作者：郝瑞军庄艳娜燕超么帅高宏雷秦立廷高玉龙曾祥伟王笑梅东北林业大学野生动物资源学院黑龙江哈尔滨150040 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为了解雀形目野生鸟类感染禽内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）的情况,采集了352份样品,应用PCR方法进行了初筛。然后将阳性样品适当处理后接种CEF细胞,利用IFA等方法进一步鉴定。结果分离到2株病毒WB11042和WB110... 详细信息

为了解雀形目野生鸟类感染禽内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）的情况,采集了352份样品,应用PCR方法进行了初筛。然后将阳性样品适当处理后接种CEF细胞,利用IFA等方法进一步鉴定。结果分离到2株病毒WB11042和WB11043,分别来自黄喉鹀和燕雀。对2株REV分离株的gp90基因进行扩增、测序和序列分析。结果显示,其gp90序列与REV亚型Ⅲ的代表毒株（CSV、APC-566）亲缘关系最近,高达99%以上;与亚型Ⅱ代表株（SNV）和亚型Ⅰ代表株（HA9901）的亲缘关系相对较远,在95.5%~97.1%之间。遗传进化树分析也表明这2株野生鸟类分离株属于REV亚型Ⅲ。结果表明,雀形目野生鸟类也可以感染REV。

关键词：野生鸟类 REV gp90 序列分析

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高致病性PRRS VORF3基因在昆虫细胞中的表达与免疫原性研究

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中国预防兽医学报 2010年第6期32卷 455-459页

作者：徐明明蔡雪辉刘永刚王淑杰王洪峰石文达李丽琴荣福龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150030

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3的结构、功能和免疫学特性,本研究根据GenBank登录的高致病性PRRSV变异株(HP-PRRSV) HuN4株ORF3基因序列,经序列分析去除其N端的一部分疏水性区域(1aa～49aa),设计合成引物。将扩增的基因... 详细信息

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3的结构、功能和免疫学特性,本研究根据GenBank登录的高致病性PRRSV变异株(HP-PRRSV) HuN4株ORF3基因序列,经序列分析去除其N端的一部分疏水性区域(1aa～49aa),设计合成引物。将扩增的基因连接于pFastBac HTb杆状病毒载体中,构建重组质粒pF-ORF3,转化至感受态DH10Bac中,获得重组杆粒rBac-ORF3。再将其转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rAc-ORF3。用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)分析表明GP3在昆虫细胞Sf9中获得正确表达,而且具有良好的反应活性。用纯化的GP3免疫小鼠,制备抗GP3多克隆抗血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其效价。本研究利用昆虫杆状病毒表达系统表达了重组GP3,经GP3免疫的小鼠体内产生了较高滴度的特异性抗体,证明表达的GP3具有特异的免疫原性。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF3 杆状病毒表达免疫原性

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宿主蛋白核仁素与病毒基因组相互作用对牛肠道病毒复制影响的研究

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中国预防兽医学报 2022年第6期44卷 598-605页

作者：魏丹丹孙超常继涛于力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病创新团队黑龙江哈尔滨1550069

为了探究宿主蛋白核仁素(NCL)对牛肠道病毒(BEV)复制的影响及其作用机制,本研究将构建的重组质粒pHA-NCL和NCL shRNA分别转染BHK-21细胞,采用western blot检测细胞中NCL的表达。结果显示,NCL在BHK-21细胞中分别获得了过表达和下调表达... 详细信息

为了探究宿主蛋白核仁素(NCL)对牛肠道病毒(BEV)复制的影响及其作用机制,本研究将构建的重组质粒pHA-NCL和NCL shRNA分别转染BHK-21细胞,采用western blot检测细胞中NCL的表达。结果显示,NCL在BHK-21细胞中分别获得了过表达和下调表达。在此基础上,将BEV以MOI 1感染上述过表达和下调NCL表达的BHK-21细胞,于感染8 h、10 h和12 h时收集上清液和细胞,采用qPCR、western blot(检细胞)分别检测病毒基因组RNA的复制水平、BEV结构蛋白VP1表达水平及通过上清液检测病毒滴度的变化。结果表明,过表达NCL明显促进BEV在BHK-21细胞中的复制,而下调NCL的表达则明显抑制BEV的复制。利用兔源NCL特异性抗体及同源IgG对感染BEV的BHK-21细胞进行RNA免疫共沉淀试验,并利用RT-PCR检测免疫复合物中BEV相应基因片段。结果显示,免疫复合物NCL抗体-NCL蛋白-病毒RNA免疫复合物中扩增出BEV目的基因片段,而IgG抗体对照组未扩增出任何条带,表明NCL与BEV基因组RNA存在相互作用。通过激光共聚焦试验观察BEV感染BHK-21细胞后不同时间(5 h和10 h)NCL蛋白的亚细胞定位,结果显示,BEV感染细胞后使NCL由核仁迁移至细胞质,并与病毒基因组在细胞质中共定位。利用同源重组试剂盒将线性化的pmirGLO及扩增的BEV内部核糖体进入位点(IRES)构建双荧光素酶报告质粒pmirGLO-BEV IRES,并经测序鉴定正确后分别转染NCL过表达和下调表达的BHK-21细胞,采用双荧光素酶试剂盒分别检测上述细胞中两种荧光素酶FLuc和RLuc(BEV IRES依赖性的)的活性。结果显示,与转染pHA的对照细胞相比,NCL过表达的BHK-21细胞中FLuc值无显著变化,而RLuc值显著升高(P<0.01);与转染shRNA NC的对照细胞相比,NCL表达下调的BHK-21细胞中,FLuc值无显著变化,而RLuc值显著降低(P<0.01)。表明,NCL正调控BEV IRES的翻译起始活性。本研究首次证实NCL与BEV基因组间存在相互作用,该互作可促进BEV IRES介导的病毒蛋白翻译活性,从而提高BEV的复制水平,为BEV复制的分子调控机制提供了新的见解。

关键词：牛肠道病毒核仁素内部核糖体进入位点病毒复制

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PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗免疫特性的研究

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中国预防兽医学报 2010年第6期32卷 468-472页

作者：李丽琴蔡雪辉刘永刚王淑杰石文达徐敏荣福龙武佳斌徐明明田志军胡守萍中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150001

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株疫苗的免疫机理和明确PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗各自的免疫特性,本实验分别采用PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗免疫PRRSV抗原和抗体阴性的健康断奶仔猪,免疫后21... 详细信息

为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株疫苗的免疫机理和明确PRRSV变异株活疫苗和灭活疫苗各自的免疫特性,本实验分别采用PRRSV变异株(HuN4)活疫苗和PRRSV变异株(JXA1)灭活苗免疫PRRSV抗原和抗体阴性的健康断奶仔猪,免疫后21d用PRRSV变异株HuN4强毒攻毒,ELISA方法检测血清中PRRSV特异的抗体水平及TNF-α、IFN-α、IL-1、IL-6和CRP细胞因子水平,荧光定量RT-PCR方法检测病毒血症的发生和持续情况,并取主要器官进行病理组织学观察。结果表明:HuN4活疫苗组免疫后14d便可检测到PRRSV特异性抗体,攻毒后5d各细胞因子水平升高,攻毒后21d病毒血症完全消失,免疫后各器官没有明显病理变化,攻毒后临床症状和各组织器官病理变化轻微;JXA1株灭活苗组免疫期间没有检测到PRRSV特异性抗体,攻毒后5d～9d各细胞因子水平升高,攻毒后病毒血症持续存在,免疫后各器官有轻微病理变化,攻毒后临床症状和各组织器官病理变化比HuN4活疫苗组严重,但比对照组明显减轻。本实验表明,HuN4活疫苗能够快速有效的激发机体的体液免疫反应,在抵抗PRRSV变异株HuN4强毒攻毒时,临床症状明显优于JXA1灭活苗。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征 PRRSV变异株(HuN4)活疫苗 PRRSV变异株(JXA1)灭活苗

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1株野鸭源鸡贫血病病毒的分离鉴定及其编码区基因序列分析

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中国兽医学报 2013年第5期33卷 654-658,679页

作者：刘婉思高宏雷秦立廷杨波么帅高玉龙曾祥伟王笑梅东北林业大学野生动物资源学院黑龙江哈尔滨150040 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用MDCC细胞系从东北地区采集的死亡野生鸟类样品中分离获得1株禽类病毒,对该病毒进行特异性PCR、特异性间接免疫荧光法等系统鉴定后,证实该分离株为鸡贫血病病毒(CAV),命名为WDNE110501株。利用PCR方法克隆出其编码区基因片段,测序结... 详细信息

利用MDCC细胞系从东北地区采集的死亡野生鸟类样品中分离获得1株禽类病毒,对该病毒进行特异性PCR、特异性间接免疫荧光法等系统鉴定后,证实该分离株为鸡贫血病病毒(CAV),命名为WDNE110501株。利用PCR方法克隆出其编码区基因片段,测序结果表明,WDNE110501株的编码区全长为1823bp,无碱基缺失或插入。并将该基因序列和推导的氨基酸序列与国内外已发表的34个CAV株编码区基因进行同源性和亲缘关系的比对分析,同源性为96.1%～99.8%;氨基酸的同源性为89.8%～99.7%,与国内毒株harbin的差异最小,与国外最近的是美国毒株98D02152。序列比较表明CAV的3个编码基因VP1、VP2和VP3均有一定程度变异,以VP1变异性最大,且在不同毒株间的这3个阅读框的氨基酸序列变异是互不相关的。这是首次在野生鸟类中分离出CAV病毒,提示了我们野生鸟类在鸡传染性贫血病病毒传播和分布中可能起到一定作用。

关键词：野生鸟类鸡传染性贫血病分离鉴定序列分析

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猪流行性腹泻病毒N蛋白核仁定位信号对宿主细胞周期的影响

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中国预防兽医学报 2013年第3期35卷 173-176页

作者：刘随新石达陈建飞张鑫时洪艳刘孝珍张莎王璐冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150030

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与宿主细胞相互作用,本研究根据前期已经鉴定的PEDV N蛋白核仁定位信号序列,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增出核仁定位信号序列缺失的PEDV N基因(dN),并将其与真核表达载体pAc-GFP-C1连接... 详细信息

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与宿主细胞相互作用,本研究根据前期已经鉴定的PEDV N蛋白核仁定位信号序列,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增出核仁定位信号序列缺失的PEDV N基因(dN),并将其与真核表达载体pAc-GFP-C1连接,构建重组质粒pAc-GFP-dN。将pAc-GFP-dN转染于Vero E6细胞中,利用激光共聚焦显微镜分析重组质粒pAc-GFP-dN表达蛋白的定位情况,并利用流式细胞仪检测转染细胞的周期变化。实验结果表明:与完整的N蛋白相比,缺失核仁定位信号的N蛋白不能定位于细胞核仁,同时丧失了使宿主细胞周期在G2/M期停滞的能力,从而揭示了N蛋白核仁定位信号对宿主细胞具有重要的影响。

关键词：猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白核仁定位信号流式细胞术宿主细胞周期

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高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒感染猪外周血单核细胞cDNA文库的构建

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中国兽医科学 2009年第8期39卷 669-673页

作者：肖晶符芳李海忠张永欣柴政蔡雪辉宋淑萍李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150030

为应用CloneminerTMcDNA Library Construction Kit构建高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪的外周血单核细胞cDNA文库,以1×105TCID50PRRSV肌肉接种健康猪,攻毒后第3、5、7、9、14、21及28 d分别采集感染猪外周血,分离单... 详细信息

为应用CloneminerTMcDNA Library Construction Kit构建高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪的外周血单核细胞cDNA文库,以1×105TCID50PRRSV肌肉接种健康猪,攻毒后第3、5、7、9、14、21及28 d分别采集感染猪外周血,分离单核细胞,提取总RNA、mRNA,以mRNA为模板,通过引物Biotin-attB2-Oligo(dT)、SuperScript.ⅡRT合成5′末端具有attB1接头的cDNA。用柱层析方法纯化cDNA,纯化后的cDNA与pDONRTM222载体进行BP重组,于大肠杆菌DH10B转化,进行文库容量测定。结果表明,构建的高致病性PRRSV感染猪外周血单核细胞cDNA文库的库容量为1.36×107CFU,平均插入片段长度大于1 200 bp,重组率为94.3%,为进一步从文库中筛选未知细胞因子及相关基因提供了有效的工具。

关键词：猪生殖与呼吸综合征病毒外周血单核细胞 cDNA文库

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传染性喉气管炎病毒WG株Us区基因结构分析

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中国预防兽医学报 2008年第10期30卷 779-784页

作者：韩文雄石星明王云峰兰德松胡文玮王玫曹贵方童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018 中国农业科学院上海兽医研究所上海200232

根据GenBank中的传染性喉气管炎病毒(ILTV)全序列(NCBI登录号:NC-006623),利用Oligo6.2分析序列并设计6对引物,以ILTVWG株基因组DNA为模板,PCR扩增了长度为13.1kb的区域,得到了完整的WG株的Us区序列,初步鉴定了WG株的Us区基因结构。将W... 详细信息

根据GenBank中的传染性喉气管炎病毒(ILTV)全序列(NCBI登录号:NC-006623),利用Oligo6.2分析序列并设计6对引物,以ILTVWG株基因组DNA为模板,PCR扩增了长度为13.1kb的区域,得到了完整的WG株的Us区序列,初步鉴定了WG株的Us区基因结构。将WG株的Us区序列分别与ILTVUSDA株、BHV-1、CeHV-1、EHV-1、HSV-1、HSV-2、MDV、PrV、HVT、VZV相比较,ILTVWG株与USDA株同源性为99.2%,而与其他疱疹病毒之间的同源性较低,而且Us区大小也不一致;与已发表的ILTVUSDA株Us区基因序列分别比较后发现,两者之间差异较大的基因分别为gJ基因和gD基因。其中,gJ基因在第1983个碱基处比USDA株多出30bp,DNAStar预测这30bp可能形成一个独立的抗原表位;gD基因的长度在不同的ILTV毒株之间差别较大,与其他疱疹病毒具有相似的结构特征。

关键词：传染性喉气管炎病毒 WG株 Us区基因序列分析

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