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荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系

中国预防兽医学报 2011年第9期33卷 699-703页

作者：葛叶张兴娟朱庆虎韩秋影王牟平李伟杰孙建宏仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所维科生物技术开发公司黑龙江哈尔滨150069

为探讨荧光定量RT-PCR技术与传统兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系,本研究采用荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对5份猪瘟兔化弱毒细胞苗成品和6份半成品样品进行平行检测。结果表明,两种检测方法存在正相关性,最低... 详细信息

为探讨荧光定量RT-PCR技术与传统兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系,本研究采用荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对5份猪瘟兔化弱毒细胞苗成品和6份半成品样品进行平行检测。结果表明,两种检测方法存在正相关性,最低105个病毒拷贝可以使家兔产生定型热反应,最低103个病毒拷贝可以使家兔产生轻热反应。荧光定量RT-PCR检测方法的检测过程仅需3.5 h,大大缩短了猪瘟疫苗的检测时间,该方法可以补充传统的兔体定型热反应用于猪瘟兔化弱毒疫苗半成品与成品的检验。

关键词：猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR 兔体定型热试验

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鹌鹑β- 防御素10基因的克隆与表达及其体内分布的检测

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中国预防兽医学报 2011年第7期33卷 552-556页

作者：蔺利娟王瑞琴韩宗玺邵昱昊刘胜旺程宝晶孙黎李子瑞马得莹东北农业大学动物营养研究所黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为测定鹌鹑β-防御素10(AvBD10)体外抗菌活性及检测其在鹌鹑脏器组织的分布,本研究应用RT-PCR方法从鹌鹑肺脏组织中扩增到鹌鹑AvBD10,经序列同源性分析,鹌鹑AvBD10与鸡AvBD10的氨基酸序列同源性最高(83.8%)。将该基因亚克隆到表达载体pG... 详细信息

为测定鹌鹑β-防御素10(AvBD10)体外抗菌活性及检测其在鹌鹑脏器组织的分布,本研究应用RT-PCR方法从鹌鹑肺脏组织中扩增到鹌鹑AvBD10,经序列同源性分析,鹌鹑AvBD10与鸡AvBD10的氨基酸序列同源性最高(83.8%)。将该基因亚克隆到表达载体pGEX-6p-1中进行原核表达,SDS-PAGE电泳表明,鹌鹑AvBD10重组蛋白分子量约为31ku。该重组蛋白经纯化后测定其体外抗菌活性,结果显示,鹌鹑AvBD10重组蛋白具有广谱的抗菌活性。采用定量RT-PCR法检测到AvBD10在鹌鹑脏器组织中广泛表达。

关键词：鹌鹑 AvBD10 重组蛋白抗菌活性组织分布

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禽源U6启动子介导鸡马立克氏病病毒gI、gE基因特异siRNA的筛选及干扰活性鉴定

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中国预防兽医学报 2011年第5期33卷 335-339页

作者：全炎铭崔红玉赵妍赵晓岩石星明高宏博闫帅张晓艳王玫王云峰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物科技学院黑龙江哈尔滨150030

为筛选鸡马立克氏病病毒(MDV)gI、gE基因特异性siRNA,本研究以鸡胚成纤维细胞(CEF)的DNA为模板,扩增禽源cU6-3启动子序列,并合成针对gI和gE基因各5个靶位点的10条shRNA序列。通过重叠PCR将cU6-3启动子与shRNA融合扩增制备shRNA表达盒,... 详细信息

为筛选鸡马立克氏病病毒(MDV)gI、gE基因特异性siRNA,本研究以鸡胚成纤维细胞(CEF)的DNA为模板,扩增禽源cU6-3启动子序列,并合成针对gI和gE基因各5个靶位点的10条shRNA序列。通过重叠PCR将cU6-3启动子与shRNA融合扩增制备shRNA表达盒,将制备的shRNA表达盒分别与重组质粒pEGFP-gI或pEGFP-gE共转染CEF细胞,并根据荧光显微镜观察和流式细胞仪检测结果评价siRNA抑制融合荧光蛋白表达的效率。结果表明,gI和gE基因的抑制效率为10%～80%。分别将其中抑制效率最高的一条shRNA插入pGEM-T载体中构建重组表达质粒pcU6-shgI735和pcU6-shgE936,通过不同细胞系稳定干扰试验和抑制病毒复制试验评价其干扰活性。结果显示,pcU6-shgI735和pcU6-shgE936能够明显抑制融合蛋白的表达及MDV在CEF细胞中的增殖,并且禽源U6启动子构建的表达盒在禽源细胞(DF1)中的活性比在哺乳动物细胞(Vero、MDCK)的活性高1.21～1.45倍。本研究鉴定获得了gI和gE基因的特异性siRNA,筛选出能够抑制MDV复制的靶位点,为MDV基因的功能和抗MDV病毒研究奠定了基础。

关键词：鸡马立克氏病病毒 gI和gE基因禽源U6启动子 siRNA

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猪捷申病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2011年第9期33卷 704-708页

作者：刘杉杉赵亚荣胡峰吕超超胡泉博王贵华崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 大北农动物医学研究中心北京100097

为建立同时检测猪捷申病毒(PTV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的多重RT-PCR(mRT-PCR)检测方法,本研究以PRRSV ORF6基因、CSFV Erns基因和PTV 5'-UTR基因为对象,建立检测3种病毒的mRT-PCR方法。特异性试验表明,... 详细信息

为建立同时检测猪捷申病毒(PTV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的多重RT-PCR(mRT-PCR)检测方法,本研究以PRRSV ORF6基因、CSFV Erns基因和PTV 5'-UTR基因为对象,建立检测3种病毒的mRT-PCR方法。特异性试验表明,该方法可以特异扩增3种病毒的基因,对大肠杆菌、猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪流感病毒呈阴性反应;敏感性试验表明,PRRSV、CSFV和PTV的最低核酸检出量分别为7.11×102拷贝、7.81×103拷贝和8.43×102拷贝,略低于单一RT-PCR敏感性;应用该方法对69份送检样品进行检测,其中PRRSV、CSFV和PTV单纯感染检出率分别为28.99%、27.54%和56.52%,PRRSV和CSFV混合感染检出率为4.35%,PRRSV和PTV的混合感染检出率为11.59%,CSFV和PTV的混合感染检出率为13.04%,3种病毒的混合感染检出率为8.70%,与单一RT-PCR检测结果符合率为98.6%。本研究建立的检测方法快速简便,可以用于疾病的初步筛选,对临床早期诊断和流行病学调查具有重要意义。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒猪瘟病毒猪捷申病毒 mRT-PCR

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猪细小病毒抗体IPMA检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2011年第4期41卷 387-391页

作者：刘杉杉赵亚荣张超范吕超超胡泉博崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 大北农动物医学研究中心北京100097

建立了一种检测猪细小病毒(PPV)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA),对该方法的反应条件、特异性、敏感性和重复性进行了系统试验,并与HI和ELISA的检测结果进行了比较。结果显示,PPV种毒按照1∶100的剂量接种后第48小时固定效... 详细信息

建立了一种检测猪细小病毒(PPV)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA),对该方法的反应条件、特异性、敏感性和重复性进行了系统试验,并与HI和ELISA的检测结果进行了比较。结果显示,PPV种毒按照1∶100的剂量接种后第48小时固定效果最佳,辣根过氧化物酶-葡萄球菌A蛋白标记物的最适稀释度为1∶1 000,待检血清最适稀释度为1∶100。该IPMA方法与PCV2、PRV、PRRSV和CSFV的参考血清无交叉反应;PPV阳性血清稀释至1∶1 600时仍能检出;批内和批间重复性试验表明,该方法具有良好的重复性。符合性试验结果表明,该IPMA方法与HI和ELISA的符合率分别为96.0%与98.0%。用建立的IPMA方法检测PPV灭活疫苗免疫猪,结果免疫后第2周开始阳转,5周后全部阳转。对现地送检的400份猪血清样本进行检测,结果平均检出阳性率为86.5%。该IPMA方法的建立使PPV的血清学快速检测成为可能,可以用此方法开展PPV的抗体流行病学普查。

关键词：猪细小病毒免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测

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快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金免疫层析方法的建立

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中国预防兽医学报 2011年第9期33卷 718-722页

作者：李雪松符芳李海忠王伟陈欣郎越坤田华彬周艳君刘永刚蔡雪辉李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 齐鲁动物保健品有限公司山东济南250100

为建立一种快速、简便、灵敏的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备了胶体金颗粒,标记抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体(MAb)2D7制备免疫检测探针,将抗PRRSV N蛋白的MAb 1G7和羊抗鼠... 详细信息

为建立一种快速、简便、灵敏的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备了胶体金颗粒,标记抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体(MAb)2D7制备免疫检测探针,将抗PRRSV N蛋白的MAb 1G7和羊抗鼠IgG抗体印迹在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,经条件优化,组装成胶体金免疫层析试纸条。本研究制备的PRRSV胶体金试纸条的最低检测限度为103.0 TCID50/mL;在特异性试验中,试纸条检测PRRSV呈阳性,其它主要猪病病原均为阴性;不同批次试纸条重复检测,结果无差异;对现地猪场送检的150份病料进行PRRSV病原检测,与RT-PCR相比较,试纸条的特异性和敏感性分别为98.13%和88.37%。两种方法的一致性Kappa值为0.882。建立的PRRSV抗原胶体金免疫层析检测方法具有良好的的敏感性、特异性、重复性及现地应用性。该试纸条的研制为PRRS的快速诊断及免疫预防提供了技术手段。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金免疫层析

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鸡传染性法氏囊病超强毒VP1基因的原核表达及兔抗血清的制备

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中国家禽 2011年第2期34卷 11-14页

作者：康忠惠王永强王琦李久宽秦立廷高玉龙高宏雷祁小乐林欢王笑梅许修宏东北农业大学黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

以鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增VP1基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切处理后与经相同酶切处理的pET-30a原核表达载体连接,将酶切、PCR及测序鉴定正确的阳性重组子转化BL21(DE3)感受态细胞,融合蛋白His-VP1经IPT... 详细信息

以鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增VP1基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切处理后与经相同酶切处理的pET-30a原核表达载体连接,将酶切、PCR及测序鉴定正确的阳性重组子转化BL21(DE3)感受态细胞,融合蛋白His-VP1经IPTG诱导表达后主要以包涵体形式存在。Western blot检测到约97ku的目的蛋白能够与特异性的VP1单克隆抗体反应。将纯化的目的蛋白免疫新西兰白兔后获得了抗VP1蛋白的血清。该血清能够与重组杆状病毒rBacGxVP1感染的sf9细胞发生特异性反应,而且其ELISA抗体效价达到1∶25600。鸡传染性法氏囊病超强毒VP1基因的表达与兔抗血清的制备为病毒的检测及VP1功能的研究提供了有效工具。

关键词：鸡传染性法氏囊病超强毒 VP1 原核表达兔抗VP1血清

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猪RIG-1、TLR-9、IRF-3和IRF-7mRNA TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2011年第12期33卷 953-956页

作者：王晓玲蔺文成刘芹防崔尚金青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为建立定量检测猪Ⅰ型干扰素信号传导因子mRNA的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究针对猪Ⅰ型干扰素信号传导因子视黄酸诱导基因-1(RIG-1)、Toll样受体-9(TLR-9)、干扰素调节因子-3(IRF-3)和干扰素调节因子-7(IRF-7)的基因序列设计了特... 详细信息

为建立定量检测猪Ⅰ型干扰素信号传导因子mRNA的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究针对猪Ⅰ型干扰素信号传导因子视黄酸诱导基因-1(RIG-1)、Toll样受体-9(TLR-9)、干扰素调节因子-3(IRF-3)和干扰素调节因子-7(IRF-7)的基因序列设计了特异性的引物和探针,分别构建了各自的阳性标准重组质粒,同时选择β-actin作为管家基因,建立了检测猪RIG-1、TLR-9、IRF-3、IRF-7的Taq Man荧光定量PCR方法。结果表明:所建立的检测方法荧光定量PCR扩增均无非特异性产物产生;检测下限均达1.0×101 copies/μL;批内及批间变异系数均小于3%。利用该方法对猪细小病毒(PPV)感染48 h的ST细胞中RIG-1、TLR-9、IRF-3和IRF-7mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,RIG-1、IRF-3和IRF-7转录水平呈现上调趋势,而TLR-9转录水平呈现下调趋势。本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,适于猪Ⅰ型干扰素信号传导因子的定量检测分析。

关键词： Ⅰ型干扰素信号传导因子荧光定量PCR 检测

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传染性喉气管炎病毒WG株糖蛋白gD基因主要抗原区的表达

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中国兽医科学 2011年第2期41卷 188-192页

作者：魏秀英石星明张晶王玫赵妍胡顺磊崔红玉全炎铭闫帅陈洪岩王云峰东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为表达传染性喉气管炎病毒(ILTV)gD蛋白,根据GenBank中登录的ILTV全基因组序列(EU675324)设计了1对引物,进行gD全基因的PCR扩增,产物经纯化后连接至pGEM-T Easy载体,进行序列测定,采用DNAStar软件分析gD蛋白的抗原性,选择抗原性强的第25... 详细信息

为表达传染性喉气管炎病毒(ILTV)gD蛋白,根据GenBank中登录的ILTV全基因组序列(EU675324)设计了1对引物,进行gD全基因的PCR扩增,产物经纯化后连接至pGEM-T Easy载体,进行序列测定,采用DNAStar软件分析gD蛋白的抗原性,选择抗原性强的第256～405aa的编码片段设计引物并进行PCR扩增,结果获得截短的gD基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a中,并转化*** BL21(DE3)。经IPTG诱导后,获得大小为43.5ku的重组蛋白,命名为r-gD。Western-blot分析结果表明,r-gD具有较强的抗原性。

关键词：传染性喉气管炎病毒糖蛋白D 序列分析蛋白质免疫印迹

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J亚群禽白血病病毒gp85基因在重组杆状病毒中的表达及鉴定

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畜牧与兽医 2011年第8期43卷 4-7页

作者：倪伟秦立廷孙美玉高玉龙潘伟王笑梅刘思当中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 山东农业大学动物科技学院山东泰安271018

为获得J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的gp85蛋白,将ALV-J的gp85基因克隆至pFastBac-HTA供体质粒,将其转入DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,使gp85基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建重组穿梭载体Bacmid-gp85。通过脂质体介导,将重组穿梭载体Bacmi... 详细信息

为获得J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的gp85蛋白,将ALV-J的gp85基因克隆至pFastBac-HTA供体质粒,将其转入DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,使gp85基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建重组穿梭载体Bacmid-gp85。通过脂质体介导,将重组穿梭载体Bacmid-gp85转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacgp85。Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定结果表明ALV-J gp85蛋白在Sf9昆虫细胞中得到正确表达,表达的重组gp85蛋白分子量约为38 ku。ALV-J gp85重组蛋白在Sf9细胞中的正确表达为其功能研究和应用提供了良好的基础。

关键词： J亚群禽白血病病毒 gp85基因杆状病毒

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