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第二届全国禽病分子生物技术青年学者论坛

作者：张可心蔺利娟韩宗玺邵昱昊刘胜旺马得莹东北农业大学动物营养研究所黑龙江哈尔滨 150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物营养研究所黑龙江哈尔滨 150030

为克隆与表达鸭β-防御素5(AvBD5)基因及测定其生物学特性，本研究采用RT-PCR方法从鸭肺脏组织中扩增到鸭AvBD5，将测得的序列与已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建进化树进行同源性分析。结果显示鸭AvBD5 c... 详细信息

为克隆与表达鸭β-防御素5(AvBD5)基因及测定其生物学特性，本研究采用RT-PCR方法从鸭肺脏组织中扩增到鸭AvBD5，将测得的序列与已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建进化树进行同源性分析。结果显示鸭AvBD5 cDNA大小为201 bp，编码66个氨基酸残基，内含6个位置保守的半胱氨酸残基，分别在分子内形成Cys1-Cys5，Cys2-Cys4，Cys3-Cys6共3对二硫键，与鸡AvBD5氨基酸同源性高达97％。进一步将其亚克隆到大肠杆菌pGEX-6p-1载体中进行原核表达。重组GST融合蛋白经纯化后，通过菌落计数法测定其体外抗菌活性，盐离子浓度对其抗菌活性的影响，以及该重组GST融合蛋白对溶血活性的影响。鸭AvBD5重组蛋白分子量约为32 ku，具有良好的抗菌活性，对11种细菌均有不同程度的抑制作用，高盐浓度对其抗菌活性有一定影响。此外，该重组蛋白对鸭血红细胞无明显溶血活性。

关键词：鸭β-防御素重组蛋白分离鉴定生物学作用

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PEDV N蛋白亚细胞定位信号的鉴定

PEDV N蛋白亚细胞定位信号的鉴定

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第九届全国病毒学学术研讨会

作者：石达陈建飞时红艳张莎王璐刘随新刘孝珍冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨 150001 东北农业大学生命科学院哈尔滨150030

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鸭β-防御素5基因的分离、鉴定及其生物学作用

鸭β-防御素5基因的分离、鉴定及其生物学作用

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中国林牧渔业经济学会饲料经济专业委员会第八届学术交流大会

作者：张可心蔺丽娟韩宗玺邵昱昊刘胜旺马得莹东北农业大学动物营养研究所黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物营养研究所黑龙江哈尔滨150030

为克隆与表达鸭β-防御素5(AvBD5)基因及测定其生物学特性，本研究采用RT-PCR方法从鸭肺脏组织中扩增到鸭AvBD5，将测得的序列与已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建进化树进行同源性分析。结果显示鸭AvBD5 cDNA大小为201bp，编码66个氨基酸残基，内含6个位置保守的半胱氨酸残基，分别在分子内形成Cys1-Cys5，Cys2-Cys4，Cys3-Cys6共3对二硫键，与鸡AvBD5氨基酸同源性高达97％。进一步将其亚克隆到大肠杆菌pGEX-6p-1载体中进行原核表达。重组GST融合蛋白经纯化后，通过菌落计数法测定其体外抗菌活性，盐离子浓度对其抗菌活性的影响，以及该重组GST融合蛋白对溶血活性的影响。鸭AvBD5重组蛋白分子量约为32 ku，具有良好的抗菌活性，对11种细菌均有不同程度的抑制作用，高盐浓度对其抗菌活性有一定影响。此外，该重组蛋白对红细胞溶血活性极低。

关键词：鸭β-防御素5基因生物学特性抗菌活性重组蛋白

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禽网状内皮组织增生病诊断与防制研究进展

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畜牧兽医科技信息 2011年第5期27卷 12-13页

作者：吴俊铭任晓峰邓小芸王笑梅东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001 黑龙江科技职业学院双城150111

禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis,RE)是禽类一种重要的致瘤性和免疫抑制性疾病。近年来,鸡群中REV流行比较严重;REV与马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)、鸡贫血病病毒(Chicken infectious anemia,CAV)和J亚... 详细信息

禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis,RE)是禽类一种重要的致瘤性和免疫抑制性疾病。近年来,鸡群中REV流行比较严重;REV与马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)、鸡贫血病病毒(Chicken infectious anemia,CAV)和J亚群禽白血病病毒(Subgroup J Avian Leukosis Virus,ALV-J)等几种免疫抑制性病毒的混合感染也比较普遍。鉴于REV正越来越受到重视。本文就RE的诊断和综合防制作一综述。

关键词：禽网状内皮组织增生病(RE) 诊断防制

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检测猪捷申病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR方法的建立及应用

检测猪捷申病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR...

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中关村全球农业生物技术创新论坛

作者：刘杉杉赵亚荣吕超超王贵华胡峰蔺文成王晓玲崔尚金中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨 150001 大北农动物医学中心北京 100097

猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪捷申病毒(PTV)是严重危害中国养猪业的重要病毒，经常继发或者混合感染。为了建立同时检测PTV、CSFV和PRRSV的多重RT-PCR(mRT-PCR)检测方法，本试验根据国内外发表的有关检测PRRSV、C... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪捷申病毒(PTV)是严重危害中国养猪业的重要病毒，经常继发或者混合感染。为了建立同时检测PTV、CSFV和PRRSV的多重RT-PCR(mRT-PCR)检测方法，本试验根据国内外发表的有关检测PRRSV、CSFV和PTV的引物．对比GenBank中登录的这3种病毒的序列。选出3对引物．通过优化反应条件，建立了检测这3种病毒的mRT-PCR检测方法，并进行了特异性试验和敏感性试验。特异性试验表明，mRT-PCR可以特异扩增出PRRSV ORF6基因45lbp片段、CSFV Ems基因343bp片段、PTV 5 -UTR基因163bp片段，而对大肠杆菌、猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪流感病毒不能扩出;敏感性试验表明，mRT-PCR方法中3种病毒的最低核酸检出量分别是7.11×102(PRRSV),7.8l×103，(CSFV)，8.43×102(PTV)拷贝数/μL，比单个RT-PCR敏感性略低。利用该方法对69份送检病料样品进行检测，其中PRRsV和CSFV混合感染检出率为4.35％。PRRSV和PTV的混合感染检出率为11.59％，CSFV和PTV的混合感染检出率为13.04％，3种病毒的混合感染检出率为8.70％，与单个RT-PCR检测结果对比，符合率为98．6％。该方法快速简便，可以作为疾病的初步筛选。对临床早期诊断和流行病学调查具有重要意义。

关键词：猪繁殖障碍 RNA病毒多重RT-PCR检测临床应用

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猪捷申病毒8型rVP1-ELISA方法的建立及初步应用

猪捷申病毒8型rVP1-ELISA方法的建立及初步应用

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中关村全球农业生物技术创新论坛

作者：胡峰刘朝霞胡泉博崔尚金刘杉杉赵亚荣吕超超王贵华蔺文成王晓玲张超范王朝中国农业科学院哈尔滨兽医研究所善医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室，黑龙江哈尔演 150001 大北农动物医学中心北京 100097

为建立猪捷申病毒(PTV)抗体检测方法，根据PTV-8 Jilin，2003的VP1基因组设计一对引物，利用RT-PCR扩增VPI基因,然后克隆至原核表达载体pET-30a中，获得重组质粒pET-VP1．并利用大肠杆菌Rosetta高效表达VP1蛋白。经鉴定表达的重组蛋白... 详细信息

为建立猪捷申病毒(PTV)抗体检测方法，根据PTV-8 Jilin，2003的VP1基因组设计一对引物，利用RT-PCR扩增VPI基因,然后克隆至原核表达载体pET-30a中，获得重组质粒pET-VP1．并利用大肠杆菌Rosetta高效表达VP1蛋白。经鉴定表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在，分子量为36.2 ku，免疫印迹实验表明获得的重组蛋白具有良好的反应原性。应用***亲和层析柱纯化重组蛋白后作为ELISA诊断包被抗原，建立间接ELISA方法。经反应条件优化确定最佳抗原包被浓度为1μg/mL;待检血清最佳稀释倍数为1：100．其作用时间为60min;酶标二抗最佳稀释倍数为1：5000．其作用时间为30min;封闭液为8％的脱脂乳;显色时间为10min;阴阳性临界值为0.3。利用建立的方法对临床样品进行检测并与IFA作比对试验，结果表明该方法特异、敏感、重复性较好，适于PTV抗体检测。这为PTV抗体检测和流行病学调查提供了一种简便、快速的血清学检测方法。

关键词：猪捷申病毒抗体检测基因表达蛋白包被抗原间接ELISA法

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猪流行性腹泻病毒M蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

猪流行性腹泻病毒M蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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中关村全球农业生物技术创新论坛

作者：张志榜陈建飞时洪艳杨斌石达陈小金冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001 内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018

为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白单克隆抗体(MAb)，本研究以截短表达的His-M重组蛋白免疫BABL/c小鼠：以截短表达的GST-M重组蛋白作为包被抗原，采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，通过间接ELISA进行筛选，得到一株稳... 详细信息

为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白单克隆抗体(MAb)，本研究以截短表达的His-M重组蛋白免疫BABL/c小鼠：以截短表达的GST-M重组蛋白作为包被抗原，采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，通过间接ELISA进行筛选，得到一株稳定分泌抗M蛋白MAb。MAb亚类鉴定为IgG2b型，轻链为k链，杂交瘤细胞培养上清和诱导的小鼠腹水抗体效价分别为1：3000和1：(2×105)。Western blot验证明该MAb能够识别重组及天然的PEDVM蛋白。IFA试验表明该MAb能够与PEDV感染的Veto E6细胞产生特异性免疫荧光。

关键词：猪流行性腹泻病毒跨膜蛋白原核表达单克隆抗体

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猪圆环病毒2型Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定

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中国农业科学 2010年第7期43卷 1480-1486页

作者：郭龙军陆月华黄立平危艳武刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室/兽医生物技术国家重点实验室

【目的】猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原,其基因组ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,起保护性抗原作用,对其进行抗原表位鉴定十分必要。【方法】本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免... 详细信息

【目的】猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原,其基因组ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,起保护性抗原作用,对其进行抗原表位鉴定十分必要。【方法】本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免疫原制备5株单克隆抗体,通过原核表达系统对ORF2基因进行了截短表达,先行对Cap蛋白抗原表位进行宽幅定位,然后利用合成多肽对Cap抗原表位做精确扫描定位。【结果】5株单抗中有4株针对同一抗原表位,坐落在Cap蛋白N末端核定位信号区,经多肽扫描证实,核心序列为26RPWLVHPRHRY36;另1株单抗(1D2)仅与重组Cap蛋白产生免疫活性反应,对4个分段截短表达的Cap蛋白无免疫活性反应,鉴于该单抗具有中和病毒活性,针对的可能是构象表位。【结论】本研究首次鉴定出位于Cap蛋白核定位信号区的一个抗原表位,为以后Cap蛋白功能及核定位机理的研究奠定基础。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白抗原表位多肽扫描核定位信号

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猪瘟病毒野毒株与疫苗株双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2010年第11期32卷 854-857页

作者：王伟符芳陈欣李雪松李海忠李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

为建立猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)与野毒株的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank登录的CSFV C株与野毒株的E2基因序列差异,设计2对特异性引物,建立了同时检测C株与野毒株的双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。应用该方法对CSF... 详细信息

为建立猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)与野毒株的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank登录的CSFV C株与野毒株的E2基因序列差异,设计2对特异性引物,建立了同时检测C株与野毒株的双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。应用该方法对CSFV野毒和疫苗株的最低检出量为10拷贝;检测牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型4种病毒均呈阴性;批内、批间重复试验的变异系数均低于3%。应用该方法检测从黑龙江省各地区猪场采集的600份样品,结果表明野毒株的阳性率为30.5%。该方法可应用于CSFV野毒株和C株的鉴别检测。

关键词： SYBRGreenⅠ实时荧光PCR 猪瘟病毒野毒株 C株

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禽传染性支气管炎病毒鸡胚连续传代后3'端7 kb编码区核酸变异特性

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中国预防兽医学报 2010年第4期32卷 315-318,324页

作者：闫宝龙张晓楠龚利洋韩宗玺邵昱昊孔宪刚刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

CK/CH/LHLJ/04V在鸡胚上连续传代后,其致病力、免疫原性和组织嗜性均发生了改变。为了研究其生物学特性变化的分子特征,通过RT-PCR的方法扩增出4个不同代次(P3、P40、P70、P110)的毒株的3'端7kb区域,克隆于pMD18-T中进行测序。序列... 详细信息

CK/CH/LHLJ/04V在鸡胚上连续传代后,其致病力、免疫原性和组织嗜性均发生了改变。为了研究其生物学特性变化的分子特征,通过RT-PCR的方法扩增出4个不同代次(P3、P40、P70、P110)的毒株的3'端7kb区域,克隆于pMD18-T中进行测序。序列分析表明CK/CH/LHLJ/04V病毒群中含有基因突变的各种亚群。3'端7kb区域的氨基酸替换主要发生在S蛋白。P3和P40中,S1亚基中的氨基酸替换,同样发生在病毒传代过程中的其它亚群中。但是P70和P110中的另一些氨基酸替换却仅发生在某些亚群中。P70和P110的大部分亚群中,3'非编码区出现109bp的缺失,这可能与病毒的复制、转录和致病力有关。病毒3'端7kb区域的变化很可能导致了病毒毒力的减弱、免疫原性的降低和组织嗜性的变化。

关键词：禽传染性支气管炎病毒改变分子特性 3'端7 kb区域

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