检索结果-内蒙古大学图书馆

微生物学报 2009年第5期49卷 677-682页

作者：任宪刚薛飞朱远茂童光志王延辉冯军科祖立闯李娇史鸿飞高欲燃中国农业科学院哈尔滨兽医研究所大动物传染病研究室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

【目的】为了构建表达口蹄疫病毒(O/China/99)VP1基因的牛疱疹病毒1型,将人工合成的口蹄疫病毒VP1基因插入到巨细胞病毒(CMV)启动子之下构建gE基因缺失转移载体。【方法】利用磷酸钙介导转染法将该转移载体与亲本病毒BHV-1/gE-/LacZ+的... 详细信息

【目的】为了构建表达口蹄疫病毒(O/China/99)VP1基因的牛疱疹病毒1型,将人工合成的口蹄疫病毒VP1基因插入到巨细胞病毒(CMV)启动子之下构建gE基因缺失转移载体。【方法】利用磷酸钙介导转染法将该转移载体与亲本病毒BHV-1/gE-/LacZ+的基因组DNA共转染牛鼻甲细胞后收获增殖的病毒。通过筛选白色病毒蚀斑,得到重组病毒BHV-1/gE-/VP1。【结果】PCR检测结果表明VP1基因已经插入到了重组病毒BHV-1/gE-的基因组中,间接免疫荧光试验和Western blot证实了BHV-1/gE-/VP1中的VP1基因在感染的细胞中获得了表达。【结论】本研究成功地构建了表达口蹄疫病毒VP1基因的重组病毒BHV-1/gE-/VP1,为研制口蹄疫及其他重要牛传染病的BHV-1病毒载体疫苗奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 VP1基因牛疱疹病毒1型磷酸钙介导转染

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纹身法免疫增强DNA疫苗免疫效果的评价

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畜牧兽医学报 2009年第7期40卷 1048-1053页

作者：曾伟伟石星明黄婷婷王玫高宏博孙妍李继松王云峰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001

为评价不同DNA免疫方法(皮内穿刺、肌肉注射)对DNA疫苗免疫效果的影响,将自行构建的表达传染性喉气管炎病毒gJ基因的真核表达载体pCDNA3.1-gJ和表达新城疫病毒F基因的真核表达载体pVAX1-F通过普通注射器裸DNA肌肉注射和纹身器皮下裸DNA... 详细信息

为评价不同DNA免疫方法(皮内穿刺、肌肉注射)对DNA疫苗免疫效果的影响,将自行构建的表达传染性喉气管炎病毒gJ基因的真核表达载体pCDNA3.1-gJ和表达新城疫病毒F基因的真核表达载体pVAX1-F通过普通注射器裸DNA肌肉注射和纹身器皮下裸DNA纹身法投递,分别免疫BALB/c小鼠和SPF鸡,三免后2周用NDV强毒株进行攻毒。采集免疫后小鼠和鸡的血清,ELISA法检测抗体水平,并计算鸡攻毒后保护率,来评价这2种免疫途径的免疫效果。结果表明,纹身法皮下投递诱导的特异性免疫应答抗体水平显著高于DNA肌肉注射的抗体水平,而且通过纹身法投递质粒二免后产生的抗体水平显著高于肌肉注射三免后的抗体水平。此外,通过纹身法投递50μg质粒产生的抗体水平高于同一时期通过肌肉注射100μg质粒产生的抗体水平;攻毒试验表明,和肌肉注射免疫相比,纹身法皮肤免疫的免疫保护效果更佳。以上结果表明,纹身法皮下投递DNA疫苗,能诱导产生更强大的免疫应答,而且还是一种经济实用的方法,它将满足实验室条件下产生更快更强大免疫应答的需要,也为今后DNA疫苗免疫方法和途径研究提供新的思路。

关键词： DNA免疫纹身法 DNA疫苗免疫途径

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鸡马立克氏病病毒流行毒株高代次细胞毒株Meq、RLORF4、RLORF12及132bpr基因变异分析

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病毒学报 2009年第5期25卷 368-375页

作者：刘爱玲刘长军张艳萍李晶梅施维松闫福海张锋程志伟中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030

根据鸡马立克氏病病毒（Marek′s disease virus,MDV）GA株的全基因组序列,设计合成了用于扩增MDVMeq、RLORF4、RLORF12及132bpr基因的引物,分别扩增4株MDV流行强毒株的高代次细胞毒株（L-SYp85C、L-MSp75C、L-CZp75C、L-ZYp75C）及相应亲本毒株（L-SY、L-MS、L-CZ、L-ZY）、MDV强毒J-1株、814疫苗株等10个毒株的Meq、RLORF4、RLORF12和132bpr基因。经克隆测序后,分析4个高代次细胞毒株中相应基因的变异,并与MDV强毒J-1株、814疫苗株及GenBank中已发表MDV毒株的相应序列进行比较。序列比对分析发现,L-CZp75C株Meq基因的第625位存在碱基C插入突变;L-ZYp75C株Meq基因第529位存在碱基C插入,且第602位缺失碱基T,从而致使Meq基因推导的相应氨基酸序列在第177~200位发生移码突变。L-SYp85C株RLORF4基因在第215~265位缺失51bp,致使该基因推导的氨基酸序列相应缺失17个氨基酸残基。分析RLORF12基因序列,发现L-MSp75C株在第67位存在碱基T缺失,814疫苗株在第18~86位缺失69 bp,缺失位置均位于复制起点（Origin of replication,,Ori）内;而L-ZYp75C毒株在RLORF12基因第168~174位存在独特的TGTTGGG碱基缺失。4个细胞高代次毒株的132 bpr基因的扩增结果表明,该基因在病毒基因组中的拷贝数明显增加,可达到10个拷贝以上。上述分析结果提示,4株MDV流行强毒株经体外连续传代后,MDV致瘤相关基因Meq、RLORF4、RLORF12和132bpr基因等发生了缺失突变或插入突变。

关键词：马立克氏病病毒 Meq RLORF4 RLORF12 132bpr

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一株鹅源H5N2亚型高致病性禽流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析

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生物化学与生物物理进展 2009年第1期36卷 65-71页

作者：刘春国刘明张云刘大飞潘蔚绮孙恩成杜金玲李洪涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感中心及国家禽流感参考实验室哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病实验室哈尔滨150001 中国科学院广州生物医药与健康研究院广州510663 黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆163319 东北农业大学动物医学院哈尔滨150030

分离到一株鹅源H5N2亚型高致病性禽流感病毒,SPF鸡静脉接种致病指数为2.99,但鸭子对该病毒不敏感.病毒感染小鼠后不致病,但能够在肺内有效复制,表明其具有感染哺乳动物的潜在风险.血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白裂解位点上插入有多个连... 详细信息

分离到一株鹅源H5N2亚型高致病性禽流感病毒,SPF鸡静脉接种致病指数为2.99,但鸭子对该病毒不敏感.病毒感染小鼠后不致病,但能够在肺内有效复制,表明其具有感染哺乳动物的潜在风险.血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白裂解位点上插入有多个连续的碱性氨基酸(-RRRKKR-),从分子上证实这是一株高致病性禽流感病毒.核酸序列比较分析表明,分离的流感病毒HA基因与A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)同源率达到99.4%,神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因与A/chicken/Jilin/53/01(H9N2)同源率达到99.8%;氨基酸水平上,HA与2004年分离到的A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)、A/swan/Guangxi/307/2004(H5N1)、A/wildduck/Guangdong/314/2004(H5N1)和A/chicken/Henan/210/2004(H5N1)同源率均为99.3%,NA与A/chicken/Jilin/53/01(H9N2)同源率为99.6%.进化树分析结果表明,该流感病毒分离株可能是由H5N1和H9N2两个亚型病毒重排而来.

关键词：鹅禽流感病毒 H5N2亚型致病性序列分析

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优化的复合自动诱导培养基(CAI-4)对外源蛋白在大肠杆菌中表达的影响

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微生物学报 2009年第1期49卷 128-134页

作者：徐灵龙石星明王云峰孙妍王玫中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001 北京爱德士元亨生物科技有限公司北京101300

[目的]原核表达系统是目前最为广泛使用的一种外源蛋白表达系统。在利用原核表达系统表达目的蛋白的过程中，可溶性外源蛋白的产量是决定成本和效率的决定性因素。[方法]本项研究中利用本实验室构建的7种不同的重组质粒（p-1、p-2、p-3... 详细信息

[目的]原核表达系统是目前最为广泛使用的一种外源蛋白表达系统。在利用原核表达系统表达目的蛋白的过程中，可溶性外源蛋白的产量是决定成本和效率的决定性因素。[方法]本项研究中利用本实验室构建的7种不同的重组质粒（p-1、p-2、p-3、p-4、p-5、p-6、p-7），检测其在复合自动诱导培养基中的表达情况，评价哪一种培养基更适合于外源蛋白的表达，提高目的蛋白的产量。[结果]结果显示，这7种重组蛋白在复合自动诱导培养基的表达量是普通LB培养基的4-8倍；并在此基础上，对复合培养基的成份进行进一步优化，形成了一种优化培养基（改良培养基-4），P-1、P-2、P-3这3种融合蛋白在这种改良培养基中的表达量比优化前提高了至少2倍。

关键词：蛋白表达培养基自动诱导条件优化

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鸡传染性法氏囊病病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2009年第1期31卷 65-68页

作者：王永强祁小乐高宏雷高玉龙宇文延青林欢秦立廷宋修庆王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

本试验根据GenBank中鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组设计一对针对病毒vp5基因的引物和一条特异性Taq Man探针,建立了一种快速检测IBDV核酸载量的Taq Man荧光定量RT-PCR方法。通过对反应条件和反应体系的优化,使得该方法在108拷贝/μL... 详细信息

本试验根据GenBank中鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组设计一对针对病毒vp5基因的引物和一条特异性Taq Man探针,建立了一种快速检测IBDV核酸载量的Taq Man荧光定量RT-PCR方法。通过对反应条件和反应体系的优化,使得该方法在108拷贝/μL～101拷贝/μL范围内具有良好的线性关系。能够灵敏地检测初始模板中30个拷贝的病毒核酸,其灵敏度是常规RT-PCR检测方法的100倍。该方法不与其它的禽源病毒发生非特异性反应,并且具有良好的重复性,为IBDV的定性定量检测提供了有效的工具。

关键词：鸡传染性法氏囊病病毒荧光定量RT-PCR Taq Man水解探针

来源：评论

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基于CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立

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中国免疫学杂志 2009年第2期25卷 159-163页

作者：赵和平孙元袁远仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

目的:建立一种方便可靠的评价猪只细胞免疫水平的试验方法。方法:用终浓度分别为3、6、9和12μg/ml的刀豆素A(ConA)刺激经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色的猪外周血单个核细胞(PBMC)3、5和7天,然后用荧光标记的单克隆抗体对C... 详细信息

目的:建立一种方便可靠的评价猪只细胞免疫水平的试验方法。方法:用终浓度分别为3、6、9和12μg/ml的刀豆素A(ConA)刺激经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色的猪外周血单个核细胞(PBMC)3、5和7天,然后用荧光标记的单克隆抗体对CD4+和CD8+细胞进行标记,最后利用流式细胞术分析。结果:不同浓度ConA刺激后,猪PBMC增殖能力不同,ConA浓度为6μg/ml时CD4+和CD8+细胞的细胞分裂指数最大,用MTT试验也获得相似结果。对PBMC刺激5天后进行分析相对较好。结论:建立了一种基于活细胞染料CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法,该方法可以在单个细胞水平上有效地分析刺激后CD4+和CD8+细胞亚群的增殖水平,进而评价细胞免疫水平。

关键词：猪淋巴细胞细胞免疫 CFSE染色淋巴细胞增殖试验

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禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因在杆状病毒中的表达及其产物的活性分析

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中国兽医科学 2009年第11期39卷 973-977页

作者：高立祁小乐高玉龙高宏雷秦立廷邓小芸王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

以质粒pMD18T-env为模板,利用PCR技术扩增禽网状内皮组织增生病病毒的gp90基因,酶切、纯化后,克隆至载体pFastBacHTA中,构建了重组供体载体pFgp90,并将其转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使gp90基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭... 详细信息

以质粒pMD18T-env为模板,利用PCR技术扩增禽网状内皮组织增生病病毒的gp90基因,酶切、纯化后,克隆至载体pFastBacHTA中,构建了重组供体载体pFgp90,并将其转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使gp90基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体Bacmidgp90。通过脂质体介导将其转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacgp90。抗gp90蛋白小鼠超免疫血清介导的Western-blot分析和间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,gp90蛋白被正确表达,分子质量约为45 ku;gp90蛋白在变性和自然状态下均能够被识别,具有良好的生物活性。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒 gp90基因 sf9细胞杆状病毒生物活性

来源：评论

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鸡马立克病毒野毒株在鸭胚成纤维细胞上的培育及鉴定

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中国兽医科学 2009年第3期39卷 219-222页

作者：张艳萍刘长军李晶梅刘爱玲施维松闫福海秦运安中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

用2006-2007年从现地采集的疑似感染鸡马立克病（MD）鸡羽髓分别接种鸭胚成纤维细胞（DEF），蚀斑克隆纯化后，随机选1个单克隆，再接种DEF增殖，获得9株适应DEF的鸡马立克病病毒（MDV）野毒株，分别命名为ZY、FY、SY、YC、CZ、MS、CGZ... 详细信息

用2006-2007年从现地采集的疑似感染鸡马立克病（MD）鸡羽髓分别接种鸭胚成纤维细胞（DEF），蚀斑克隆纯化后，随机选1个单克隆，再接种DEF增殖，获得9株适应DEF的鸡马立克病病毒（MDV）野毒株，分别命名为ZY、FY、SY、YC、CZ、MS、CGZ、QQHE和DH。应用PCR技术分别扩增这9株MDV的132bp重复序列（132bpr），发现这9株132bpr均为2个拷贝，符合致病型MDV的特点。从分离的9株MDV中选择5株，人工感染7日龄SPF白来航鸡。试验鸡表现精神萎靡，被毛凌乱，个体瘦小；60d后剖杀，大多可见内脏肿瘤；SY、FY、QQHE3株的MD临床阳性率达100％。

关键词：马立克病病毒鸭胚成纤维细胞培育及鉴定 132 bp重复序列

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IBDV血清Ⅱ型VP5蛋白原核表达及型特异性单克隆抗体的制备

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中国预防兽医学报 2009年第4期31卷 292-296页

作者：秦立廷祁小乐高宏雷高玉龙王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

本实验构建表达了传染性法氏囊病病毒(IBDV)血清Ⅱ型23/82株VP5蛋白,并制备出能够区分不同血清型IBDV的单克隆抗体(mAb)。利用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pUC57-23/82VP5质粒,获得23/82株IBDVVP5基因片段,连接到同样处理的原核表达质粒pET-28a... 详细信息

本实验构建表达了传染性法氏囊病病毒(IBDV)血清Ⅱ型23/82株VP5蛋白,并制备出能够区分不同血清型IBDV的单克隆抗体(mAb)。利用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pUC57-23/82VP5质粒,获得23/82株IBDVVP5基因片段,连接到同样处理的原核表达质粒pET-28a,经酶切鉴定获得重组质粒pET-23/82VP5,转化到宿主菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白,SDS-PAGE分析表明该融合蛋白分子量大小约为23ku。Ni-NTA柱纯化重组蛋白,复性后免疫8周龄BALB/c小鼠,3次免疫后,常规方法进行细胞融合,获得1株阳性杂交瘤细胞株(5D3),IFA和westernblot分析表明该细胞株分泌的mAb仅与血清Ⅱ型IBDV23/82株VP5反应,不与血清Ⅰ型IBDVGt株VP5反应。腹水抗体间接ELISA效价为1×104。该mAb的制备为研究血清Ⅱ型IBDV的VP5的功能和标记疫苗的研制奠定了基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒 VP5 原核表达单克隆抗体

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