检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2008年第4期24卷 598-603页

作者：王煜高辉陈川赵和平李淼孙元仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室

为了比较不同启动子在杆状病毒/昆虫细胞中的活性,利用对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,wssv)的ie1启动子及其截短的mie1启动子、杆状病毒ETL启动子及其加长的mETL启动子以及杆状病毒多角体启动子P_(PH),构建了含有不同... 详细信息

为了比较不同启动子在杆状病毒/昆虫细胞中的活性,利用对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,wssv)的ie1启动子及其截短的mie1启动子、杆状病毒ETL启动子及其加长的mETL启动子以及杆状病毒多角体启动子P_(PH),构建了含有不同启动子控制下的EGFP报告基因的重组杆状病毒,分别感染Sf9昆虫细胞,利用流式细胞术检测报告基因的表达水平。结果表明,WSSV的ie1启动子和杆状病毒的mETL启动子在昆虫细胞sf9细胞中都具有较强而旱的启动子活性,能够控制报告基因早期高效表达,而P_(PH)在感染后期才表现较强活性。并且研究中发现,杆状病毒同源重复区(hr1)可以增强ETL启动子的活性。

关键词：重组杆状病毒启动子活性流式细胞术

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鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗

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中国科技成果 2009年第21期10卷 8-8页

作者：王云峰童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

本课题的研究起始于1996年，得到“九五”国家高技术研究发展计划（863计划）课题（课题名称：鸡传染性喉气管炎、马立克氏病和新城疫二价、三价基因工程疫苗的研究）的支持（1996～2000年）。后来，该成果又得到了“十五”国家863计划... 详细信息

本课题的研究起始于1996年，得到“九五”国家高技术研究发展计划（863计划）课题（课题名称：鸡传染性喉气管炎、马立克氏病和新城疫二价、三价基因工程疫苗的研究）的支持（1996～2000年）。后来，该成果又得到了“十五”国家863计划课题（课题名称：鸡痘病毒载体多价基因工程疫苗及禽流感等亚单位疫苗的研制）的支持（2001～2005年）和农业科技成果转化资金项目课题（课题名称：传染性喉气管炎重组鸡痘病毒二价疫苗）（2001年～2003年）的资助。

关键词：鸡传染性喉气管炎基因工程疫苗重组鸡痘病毒农业科技成果转化资金项目国家863计划马立克氏病亚单位疫苗病毒载体

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鸡传染性法氏囊病病毒Gt株VP5基因缺失株感染性克隆的构建

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微生物学报 2008年第12期48卷 1666-1670页

作者：秦立廷祁小乐高玉龙高宏雷步志高王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001

传染性法氏囊病病毒(IBDV)是双链,双节段RNA病毒,其基因组由A、B两个节段组成,编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术,缺失IBDV Gt株VP5基因,通过多... 详细信息

传染性法氏囊病病毒(IBDV)是双链,双节段RNA病毒,其基因组由A、B两个节段组成,编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术,缺失IBDV Gt株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGG的β肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGmGtAΔVP5HRT,将该感染性克隆与pCAGGmGtBHRT共转染DFⅠ细胞。【结果】RT-PCR和间接免疫荧光均显示获得重组病毒,将其命名为rmGtAΔVP5。IBDV VP5基因缺失感染性克隆的成功构建为从分子水平上深入研究vp5基因功能奠定了基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒 VP5 感染性克隆重组病毒

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表达猪瘟病毒E2蛋白的重组腺病毒的构建及其在兔体内的免疫原性分析

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生物工程学报 2008年第10期24卷 1734-1739页

作者：孙元祁巧芬梁冰冰成丹李娜于墨洋王宇飞刘霓虹朱庆虎仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

为了构建猪瘟重组腺病毒载体疫苗,通过细菌内同源重组法构建了含有猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒rAdV-E2。测定其一步生长曲线,同时用间接免疫荧光试验和Western blotting检测外源基因表达,然后用rAdV-E2免疫家兔,免疫后6周用猪瘟兔化弱... 详细信息

为了构建猪瘟重组腺病毒载体疫苗,通过细菌内同源重组法构建了含有猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒rAdV-E2。测定其一步生长曲线,同时用间接免疫荧光试验和Western blotting检测外源基因表达,然后用rAdV-E2免疫家兔,免疫后6周用猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)进行攻击,攻毒后3 d取其脾脏,用实时荧光定量RT-PCR检测C株病毒RNA。结果表明,该重组腺病毒传至第10代时,毒价可达1.0×1010 TCID50/mL;外源基因可在其中得到稳定表达;rAdV-E2接种兔免疫后2周产生猪瘟特异性抗体,免疫后5 w抗体达到峰值,攻毒后rAdV-E2接种兔和C株接种兔均未出现定型热反应,从其脾脏也未检测到C株病毒RNA,而野生型腺病毒接种兔均出现了定型热反应,并且从其脾脏检测大量C株病毒RNA,其含量达到了103拷贝/μL以上。由此表明,rAdV-E2可望开发为猪瘟候选疫苗。

关键词：猪瘟病毒 E2基因重组腺病毒免疫原性家兔

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新城疫病毒F48E9株M和NP基因的原核表达

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中国兽医科学 2008年第3期38卷 181-185页

作者：闻晓波吴芬芳闫丽辉曹殿军刘培欣刘春国孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

根据新城疫病毒(NDV)F48E9国内标准强毒株编码序列设计了2对特异性引物,分别用于扩增M和NP基因。经序列测定,将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,转化***21(DE3),筛选表达NDV F48E9株M蛋白和NP蛋白的菌株。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分... 详细信息

根据新城疫病毒(NDV)F48E9国内标准强毒株编码序列设计了2对特异性引物,分别用于扩增M和NP基因。经序列测定,将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,转化***21(DE3),筛选表达NDV F48E9株M蛋白和NP蛋白的菌株。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果表明,NDV M蛋白在***21(DE3)内以可溶形式存在,而NP蛋白以包涵体的形式表达。用纯化的M和NP蛋白免疫鸡制备超免疫血清,进行Western-blot分析;结果,它们可以与真核表达系统表达的M和NP蛋白以及NDV发生特异性反应,表明,原核表达系统表达的NDV M和NP蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。

关键词：新城疫病毒 M基因 NP基因原核表达

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中国2005年～2006年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析

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中国预防兽医学报 2008年第6期30卷 420-424页

作者：马亚珍韩宗玺邵昱昊张庆霞刘胜旺孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

本研究应用RT-PCR方法扩增到我国2005年～2006年8个省市12株IBV病毒核蛋白基因,并将其进行了克隆、序列测定及分析。以疫苗株H120作为参考毒株,对12株IBV分离株核蛋白基因序列进行分析。结果发现我国分离株的N基因及其局部功能区序列存... 详细信息

本研究应用RT-PCR方法扩增到我国2005年～2006年8个省市12株IBV病毒核蛋白基因,并将其进行了克隆、序列测定及分析。以疫苗株H120作为参考毒株,对12株IBV分离株核蛋白基因序列进行分析。结果发现我国分离株的N基因及其局部功能区序列存在广泛的氨基酸替代现象。同时还发现毒株CK/CH/LSD/05Ⅰ与疫苗株H120同源性最高(93.4%)。与GenBank中的11个IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,发现本研究分离的大部分毒株(9株)分布于第Ⅰ群中,可见我国主要的IBV分离株在N基因进化关系上形成了自己独立的进化群。通过与S1基因系统发育进化树比较发现,毒株CK/CH/LSD/05Ⅰ存在基因重组现象。以上结果表明我国2005年～2006年IBV毒株存在基因突变和基因重组现象。

关键词：传染性支气管炎病毒核蛋白基因基因突变基因重组

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牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2008年第7期30卷 537-543页

作者：祖立闯朱远茂王延辉辛九庆李娇任宪刚冯军科薛飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室

用大肠杆菌表达的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组gD蛋白纯化后作为包被抗原,建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA方法。交叉反应试验表明,该重组抗原与其它常见的5种牛病阳性血清不发生交叉反应;阻断反应试验表明,IBRV病毒... 详细信息

用大肠杆菌表达的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组gD蛋白纯化后作为包被抗原,建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA方法。交叉反应试验表明,该重组抗原与其它常见的5种牛病阳性血清不发生交叉反应;阻断反应试验表明,IBRV病毒悬液能在很大程度上阻断重组抗原与阳性血清的反应,而对阴性血清没有明显影响。在重复性试验中,批内重复的变异系数小于5%,批间重复的变异系数小于15%。与中和试验相比较,符合率、敏感性和特异性分别为84.1%、85.0%和83.4%。应用该诊断方法和本实验室已建立的以IBRV全病毒作为包被抗原的ELISA诊断方法,同时检测了采集于国内11个省份的2012份血清样本,IBRVgD-ELISA检测的平均阳性率为46.0%(926/2012),而且相对于IBRV全病毒ELISA诊断方法的符合率、敏感性和特异性分别为91.9%、94.2%和90.2%。本研究所建立的IBRVgD-ELISA具有良好的敏感性和特异性,为国内IBR流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。

关键词：牛传染性鼻气管炎重组gD蛋白间接ELISA

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传染性支气管炎重组鸡痘病毒免疫鸡对LHLJ04XI株病毒攻击的免疫保护作用

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中国预防兽医学报 2008年第1期30卷 47-52页

作者：石星明王云峰王玫刘胜旺童光志何来贺笋崔红玉胡文玮韩文雄中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

将表达鸡IFN-γ基因和传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒(rFPV-IFNγ S1)接种SPF鸡后,用与S1基因亲本毒株具有相同致病型且遗传关系较近的现地分离株LHLJ04XI病毒进行攻击,评价重组疫苗对现地分离病毒的保护效果。结果显示,重组... 详细信息

将表达鸡IFN-γ基因和传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒(rFPV-IFNγ S1)接种SPF鸡后,用与S1基因亲本毒株具有相同致病型且遗传关系较近的现地分离株LHLJ04XI病毒进行攻击,评价重组疫苗对现地分离病毒的保护效果。结果显示,重组病毒在免疫后1周即可检出ELISA抗体,并且免疫组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞含量均有显著上升。当用LHLJ04X I株病毒及亲本毒LX4攻击后,免疫鸡的肝脏、肾脏、脾脏及肺脏等脏器的病理损伤程度明显轻于非免疫对照组,排毒时间缩短,攻毒后现地分离株攻击的免疫组的发病率为27.3%(3/11),死亡率为9.1%(1/11),亲本毒攻击的免疫组发病率为26.67%(4/15),死亡率为6.67%(1/15),两者没有明显差异,而非免疫对照组的发病率和死亡率分别为100%(11/11)和45.5%(5/11),与免疫组相比差异显著,说明重组疫苗对免疫鸡具有较好的保护效果。体重测定结果表明,攻毒前重组疫苗免疫组和非免疫对照组的体重差异不显著(P>0.05),攻毒以后免疫组体重的增加幅度高于非免疫对照组。以上结果表明,共表达鸡IFN-γ基因和传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒活载体疫苗能对异源现地分离株的攻击产生较好的免疫保护,同时也减轻了重组疫苗对体重增长的抑制作用。

关键词：传染性支气管炎鸡痘病毒免疫保护

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基因修饰对鸡新城疫病毒F48E9株HN基因DNA疫苗表达效力的影响

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生物工程学报 2008年第2期24卷 226-231页

作者：贺笋石星明王云峰王玫冉多良童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052

DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量和免疫原性有直接关系,为了提高目的基因的表达量,本研究对NDV F_(48)E_9株的HN基因进行了修饰,对修饰前后HN基因表达水平进行了比较。利用分子生物学软件将NDV F_(48)E_9株的HN基因的密码子全部替... 详细信息

DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量和免疫原性有直接关系,为了提高目的基因的表达量,本研究对NDV F_(48)E_9株的HN基因进行了修饰,对修饰前后HN基因表达水平进行了比较。利用分子生物学软件将NDV F_(48)E_9株的HN基因的密码子全部替换为鸡体内偏嗜性密码子,同时在HN基因的5′端加上同样已替换密码子的禽流感病毒HA蛋白信号肽序列以期望提高目的蛋白在细胞中的表达。修饰后HN基因命名为SoptiHN,剔除信号肽的HN基因命名为optiHN。将SoptiHN、optiHN和F_(48)E_9株的HN基因分别克隆到真核表达载体pVAX1和含有多个鸡体内最适免疫刺激序列CpG-ODN的载体pVAX1-CpG中,将他们分别命名为pV-SoptiHN、pVC-SoptiHN、pV-optiHN、pVC-optiHN和pV-HN、pVC-HN,用这些质粒转染293T细胞,48小时后间接免疫荧光和Western blotting检测细胞中瞬时表达的HN蛋白。结果显示,与未经修饰的HN基因相比,修饰后的HN基因体外瞬时表达水平明显提高,并且密码子优化与添加信号肽序列这两种途径都可以提高HN基因的体外表达量.

关键词： NDV,DNA疫苗密码子优化信号肽间接免疫荧光免疫印迹

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猪圆环病毒2型去核定位信号ORF2基因的原核表达与初步应用

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中国预防兽医学报 2008年第5期30卷 384-388页

作者：苗丽娟符芳王小武陈微晶鲁晶红李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

根据PCV2-871病毒株的已知序列设计一对引物,PCR扩增其去核定位信号的Cap基因(ORF2),通过BamHⅠ/HindⅢ双酶切位点将其克隆到表达载体pQE-32中,转化大肠杆菌M15。经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定,表明去核定位信号的Cap蛋白可以大量表达。... 详细信息

根据PCV2-871病毒株的已知序列设计一对引物,PCR扩增其去核定位信号的Cap基因(ORF2),通过BamHⅠ/HindⅢ双酶切位点将其克隆到表达载体pQE-32中,转化大肠杆菌M15。经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定,表明去核定位信号的Cap蛋白可以大量表达。Western blot、ELISA鉴定蛋白活性,继而,以重组蛋白为抗原包被ELISA板,对28份临床样品进行检测。结果表明,该蛋白具有良好的抗原活性,可以作为抗原应用于临床样品的检测。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白原核表达

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