检索结果-内蒙古大学图书馆

猪轮状病毒OSU强毒株vp7基因的克隆及其抗原表位原核表达和免疫学活性分析

中国预防兽医学报 2008年第2期30卷 136-140页

作者：时洪艳冯力陈建飞孙东波吴波平中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室/兽医生物技术国家重点实验室

参照GenBank中所收录的猪轮状病毒OSU株序列设计了一对特异性引物,RT-PCR扩增出1062bp的vp7全长基因,与参考OSU序列的核苷酸同源性达99.8%,克隆到pMD18-T载体中,获得pMD18-T-vp7阳性质粒。以阳性质粒为模板,利用引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切... 详细信息

参照GenBank中所收录的猪轮状病毒OSU株序列设计了一对特异性引物,RT-PCR扩增出1062bp的vp7全长基因,与参考OSU序列的核苷酸同源性达99.8%,克隆到pMD18-T载体中,获得pMD18-T-vp7阳性质粒。以阳性质粒为模板,利用引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物进行PCR扩增得到含有VP7中和抗原表位区域639bp的基因片段,定向克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经酶切PCR鉴定的阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG(终浓度为1.0mmol/mL)37℃诱导4h后,SDS-PAGE电泳显示表达了大小约50ku带GST标签的融合蛋白,薄层扫描显示蛋白表达融合量占菌体总蛋白的33.2%。Western blot分析表明该VP7重组蛋白可与PRV阳性血清特异性反应。

关键词：猪轮状病毒 vp7基因克隆原核表达

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猪瘟病毒野毒株与疫苗株双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2010年第11期32卷 854-857页

作者：王伟符芳陈欣李雪松李海忠李曦中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

为建立猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)与野毒株的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank登录的CSFV C株与野毒株的E2基因序列差异,设计2对特异性引物,建立了同时检测C株与野毒株的双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。应用该方法对CSF... 详细信息

为建立猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)与野毒株的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank登录的CSFV C株与野毒株的E2基因序列差异,设计2对特异性引物,建立了同时检测C株与野毒株的双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。应用该方法对CSFV野毒和疫苗株的最低检出量为10拷贝;检测牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型4种病毒均呈阴性;批内、批间重复试验的变异系数均低于3%。应用该方法检测从黑龙江省各地区猪场采集的600份样品,结果表明野毒株的阳性率为30.5%。该方法可应用于CSFV野毒株和C株的鉴别检测。

关键词： SYBRGreenⅠ实时荧光PCR 猪瘟病毒野毒株 C株

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猪圆环病毒2型感染昆明小鼠模型的建立

引用

中国兽医科学 2008年第6期38卷 475-478页

作者：苗岚飞崔尚金张超范胡守萍陈长木张垚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室

将SPF级昆明小鼠随机分为3组,即一次攻毒组(S组)12只、连续攻毒组(M组)3只和对照组(C组)12只。S组和C组小鼠于第1d分别接种RPMI1640培养液和猪圆环病毒2型(PCV2)细胞培养毒,M组小鼠于第1、7、14、28、35d连续进行PCV2接种。S组和C组小... 详细信息

将SPF级昆明小鼠随机分为3组,即一次攻毒组(S组)12只、连续攻毒组(M组)3只和对照组(C组)12只。S组和C组小鼠于第1d分别接种RPMI1640培养液和猪圆环病毒2型(PCV2)细胞培养毒,M组小鼠于第1、7、14、28、35d连续进行PCV2接种。S组和C组小鼠分别在接种后第7、14、28和42d各处死3只,M组小鼠在接种后第42d全部处死,分析其增重、病毒组织分布、抗体水平、病理组织学变化。结果,C组小鼠体重增长速率大于S组和M组,S组又明显高于M组;S组和M组小鼠体内存在病毒复制,而C组小鼠体内无病毒复制;S组和M组小鼠均产生PCV2抗体,但M组小鼠抗体水平明显高于S组,C组小鼠未检测到PCV2抗体;S组和M组小鼠有明显的病理损伤,其中淋巴结损伤最严重,C组未发现病理损伤。结果表明PCV2可以成功感染SPF昆明小鼠。

关键词： SPF昆明小鼠猪圆环病毒2型病理损伤动物模型

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牛呼吸道合胞体病毒G蛋白的截短表达与鉴定

引用

中国生物工程杂志 2008年第12期28卷 24-29页

作者：冯军科薛飞李娇祖立闯朱远茂任宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/大动物传染病研究室哈尔滨150001

将牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)G基因截短成2个片段G1和G2,然后以人工合成的牛呼吸道合胞体病毒G基因为模板,利用PCR分别扩增G1和G2基因片段,其大小分别为570 bp和308 bp。将目的片段定向克隆到pET30a... 详细信息

将牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)G基因截短成2个片段G1和G2,然后以人工合成的牛呼吸道合胞体病毒G基因为模板,利用PCR分别扩增G1和G2基因片段,其大小分别为570 bp和308 bp。将目的片段定向克隆到pET30a表达载体,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导后G1和G2基因片段均获得了表达,且为可溶性表达。利用Ni柱亲和层析法在非变性条件下纯化重组蛋白,经免疫印迹试验鉴定证明纯化的重组蛋白G1具有良好的抗原性和特异性,而重组蛋白G2无反应性。应用纯化的重组蛋白G1进行的间接ELISA与免疫印迹试验在国内牛血清中检测到了BRSV血清抗体。对建立BRSVG蛋白的血清学诊断方法和为开展BRSVG蛋白生物学功能的研究奠定了基础。

关键词：牛呼吸道合胞体病毒 G基因克隆表达

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优化的复合自动诱导培养基(CAI-4)对外源蛋白在大肠杆菌中表达的影响

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微生物学报 2009年第1期49卷 128-134页

作者：徐灵龙石星明王云峰孙妍王玫中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001 北京爱德士元亨生物科技有限公司北京101300

[目的]原核表达系统是目前最为广泛使用的一种外源蛋白表达系统。在利用原核表达系统表达目的蛋白的过程中，可溶性外源蛋白的产量是决定成本和效率的决定性因素。[方法]本项研究中利用本实验室构建的7种不同的重组质粒（p-1、p-2、p-3... 详细信息

[目的]原核表达系统是目前最为广泛使用的一种外源蛋白表达系统。在利用原核表达系统表达目的蛋白的过程中，可溶性外源蛋白的产量是决定成本和效率的决定性因素。[方法]本项研究中利用本实验室构建的7种不同的重组质粒（p-1、p-2、p-3、p-4、p-5、p-6、p-7），检测其在复合自动诱导培养基中的表达情况，评价哪一种培养基更适合于外源蛋白的表达，提高目的蛋白的产量。[结果]结果显示，这7种重组蛋白在复合自动诱导培养基的表达量是普通LB培养基的4-8倍；并在此基础上，对复合培养基的成份进行进一步优化，形成了一种优化培养基（改良培养基-4），P-1、P-2、P-3这3种融合蛋白在这种改良培养基中的表达量比优化前提高了至少2倍。

关键词：蛋白表达培养基自动诱导条件优化

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传染性法氏囊病病毒VP4酵母双杂交诱饵载体的构建及互作宿主细胞蛋白的筛选

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中国畜牧兽医 2015年第2期42卷 317-323页

作者：王念陈玉明张礼洲高立卢珍高玉龙王永强高宏雷刘长军崔红玉王笑梅祁小乐中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001

VP4蛋白(viral protein 4)是传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)编码的一种重要非结构蛋白,具有蛋白水解酶活性,剪切多聚蛋白pVP2-VP4-VP3释放出pVP2、VP4、VP3,对病毒蛋白成熟具有重要的作用。为了研究VP4蛋白... 详细信息

VP4蛋白(viral protein 4)是传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)编码的一种重要非结构蛋白,具有蛋白水解酶活性,剪切多聚蛋白pVP2-VP4-VP3释放出pVP2、VP4、VP3,对病毒蛋白成熟具有重要的作用。为了研究VP4蛋白与宿主细胞的相互作用,本研究将IBDVVP4基因克隆入pGBKT7,构建诱饵载体pGBGtVP4,自激活试验证明其无自激活活性,对酵母细胞没有毒性。运用酵母双杂交技术,从鸡胚成纤维细胞(CEF)文库中筛选VP4的互作蛋白,经初筛、测序和回转验证,获得22个候选互作宿主细胞蛋白,为深入研究IBDV VP4与宿主互作的效应和机制奠定了基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒 VP4 酵母双杂交诱饵载体互作蛋白

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禽传染性支气管炎病毒鸡胚连续传代后3'端7 kb编码区核酸变异特性

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中国预防兽医学报 2010年第4期32卷 315-318,324页

作者：闫宝龙张晓楠龚利洋韩宗玺邵昱昊孔宪刚刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

CK/CH/LHLJ/04V在鸡胚上连续传代后,其致病力、免疫原性和组织嗜性均发生了改变。为了研究其生物学特性变化的分子特征,通过RT-PCR的方法扩增出4个不同代次(P3、P40、P70、P110)的毒株的3'端7kb区域,克隆于pMD18-T中进行测序。序列... 详细信息

CK/CH/LHLJ/04V在鸡胚上连续传代后,其致病力、免疫原性和组织嗜性均发生了改变。为了研究其生物学特性变化的分子特征,通过RT-PCR的方法扩增出4个不同代次(P3、P40、P70、P110)的毒株的3'端7kb区域,克隆于pMD18-T中进行测序。序列分析表明CK/CH/LHLJ/04V病毒群中含有基因突变的各种亚群。3'端7kb区域的氨基酸替换主要发生在S蛋白。P3和P40中,S1亚基中的氨基酸替换,同样发生在病毒传代过程中的其它亚群中。但是P70和P110中的另一些氨基酸替换却仅发生在某些亚群中。P70和P110的大部分亚群中,3'非编码区出现109bp的缺失,这可能与病毒的复制、转录和致病力有关。病毒3'端7kb区域的变化很可能导致了病毒毒力的减弱、免疫原性的降低和组织嗜性的变化。

关键词：禽传染性支气管炎病毒改变分子特性 3'端7 kb区域

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传染性喉气管炎病毒WG株糖蛋白gJ基因的克隆与表达

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中国预防兽医学报 2008年第2期30卷 118-121页

作者：何来王云峰石星明崔红玉韩文雄兰德松王玫童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

根据GenBank中已发表的传染性喉气管炎病毒全基因组序列(NC006233)设计引物,以传染性喉气管炎病毒WG株基因组为模板,PCR扩增糖蛋白gJ基因,并对其进行序列分析。用DNAStar软件分析gJ蛋白的抗原性,选择抗原性强的140aa～483aa片段,克隆并... 详细信息

根据GenBank中已发表的传染性喉气管炎病毒全基因组序列(NC006233)设计引物,以传染性喉气管炎病毒WG株基因组为模板,PCR扩增糖蛋白gJ基因,并对其进行序列分析。用DNAStar软件分析gJ蛋白的抗原性,选择抗原性强的140aa～483aa片段,克隆并连接到原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)菌株。经IPTG诱导后,获得大小为65.2ku的重组蛋白,命名为r-gJ,表达量占菌体蛋白总量的60.8%;Western blot分析表明r-gJ具有较强的抗原性。

关键词：传染性喉气管炎病毒糖蛋白J(gJ) 序列分析表达抗原性

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重组杆状病毒:一种新型哺乳动物细胞基因转移载体

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中国生物工程杂志 2007年第1期27卷 126-130页

作者：彭伍平仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

昆虫杆状病毒表达载体系统已广泛应用于表达重组蛋白。近年来研究显示,含有哺乳动物细胞启动子元件的重组杆状病毒可有效地转导多种哺乳动物原代和传代细胞。借助于杆状病毒载体,已成功实现了外源基因在哺乳动物细胞内的瞬时或稳定表达... 详细信息

昆虫杆状病毒表达载体系统已广泛应用于表达重组蛋白。近年来研究显示,含有哺乳动物细胞启动子元件的重组杆状病毒可有效地转导多种哺乳动物原代和传代细胞。借助于杆状病毒载体,已成功实现了外源基因在哺乳动物细胞内的瞬时或稳定表达。而在体内,杆状病毒可被血清中的补体成份所灭活,从而抑制了转导效率,但是通过对杆状病毒进行修饰(如伪型杆状病毒),可以抵抗补体的灭活作用,杆状病毒转导机制至今尚未完全弄清。杆状病毒基因转移系统的最大特点是,杆状病毒能在昆虫细胞内大量繁殖,而不能在哺乳动物细胞内复制,因而具有很高的生物安全性;同时,此系统还具有操作简便、插入外源基因容量大等优点,使得杆状病毒作为哺乳动物细胞的基因传递载体,具有广泛的应用前景。

关键词：昆虫杆状病毒表达载体非复制型载体基因转移哺乳动物细胞

来源：评论

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基于CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立

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中国免疫学杂志 2009年第2期25卷 159-163页

作者：赵和平孙元袁远仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

目的:建立一种方便可靠的评价猪只细胞免疫水平的试验方法。方法:用终浓度分别为3、6、9和12μg/ml的刀豆素A(ConA)刺激经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色的猪外周血单个核细胞(PBMC)3、5和7天,然后用荧光标记的单克隆抗体对C... 详细信息

目的:建立一种方便可靠的评价猪只细胞免疫水平的试验方法。方法:用终浓度分别为3、6、9和12μg/ml的刀豆素A(ConA)刺激经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色的猪外周血单个核细胞(PBMC)3、5和7天,然后用荧光标记的单克隆抗体对CD4+和CD8+细胞进行标记,最后利用流式细胞术分析。结果:不同浓度ConA刺激后,猪PBMC增殖能力不同,ConA浓度为6μg/ml时CD4+和CD8+细胞的细胞分裂指数最大,用MTT试验也获得相似结果。对PBMC刺激5天后进行分析相对较好。结论:建立了一种基于活细胞染料CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法,该方法可以在单个细胞水平上有效地分析刺激后CD4+和CD8+细胞亚群的增殖水平,进而评价细胞免疫水平。

关键词：猪淋巴细胞细胞免疫 CFSE染色淋巴细胞增殖试验

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