检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医科学 2008年第6期38卷 457-460页

作者：戚亭崔尚金张超范中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

根据GenBank上登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组序列,设计了1对引物用于扩增PRRSVM基因,经PCR、酶切及测序鉴定,成功构建了PRRSV M基因原核表达载体。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting结果显示,出现一分子质... 详细信息

根据GenBank上登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组序列,设计了1对引物用于扩增PRRSVM基因,经PCR、酶切及测序鉴定,成功构建了PRRSV M基因原核表达载体。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting结果显示,出现一分子质量约为27.3ku的目的蛋白带,该表达蛋白可与PRRSV猪阳性血清发生特异性反应。表明,表达的蛋白具有良好的特异性。

关键词：猪生殖与呼吸综合征病毒 M蛋白原核表达

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猪细小病毒细胞适应株的培育及鉴定

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中国预防兽医学报 2008年第5期30卷 362-366页

作者：张超范崔尚金戚亭陈长木苗岚飞谢红玲周盛华岳丰雄刘长明刘霓虹中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

从临床表现为皮炎消瘦症状的仔猪肝脏中分离到1株病毒,经聚合酶链式反应(PCR)证实为猪细小病毒(PPV),采用仔猪原代肾细胞和传代ST细胞分离培养,经蚀斑克隆纯化,培育1株ST传代细胞培养适应毒株,命名为PPV-BQ2007株。免疫过氧化物酶单层... 详细信息

从临床表现为皮炎消瘦症状的仔猪肝脏中分离到1株病毒,经聚合酶链式反应(PCR)证实为猪细小病毒(PPV),采用仔猪原代肾细胞和传代ST细胞分离培养,经蚀斑克隆纯化,培育1株ST传代细胞培养适应毒株,命名为PPV-BQ2007株。免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测病毒抗原主要分布在细胞核及细胞质内。病毒感染细胞可被已知PPV阳性血清中和。免疫电镜可清晰见到聚集成团的大小不一的病毒粒子,近似圆形,无囊膜,直径大小约20nm～22nm。该分离株经ST细胞培养传代,能够产生典型的细胞病变,病毒滴度随代次显著增加,第30代后毒价达107TCID50/mL以上,且毒价和血凝价稳定。测序结果表明PPV-BQ2007株VP2基因与NCBI公布的皮炎型毒株Kresse株的同源性最高,达99.8%,在系统进化分支上处于同一个分支。PPV-BQ2007株传代细胞培养适应株的成功培育和鉴定,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断研究等奠定了良好基础。

关键词：猪细小病毒分离鉴定毒株培育

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实时定量PCR对猪圆环病毒2型感染猪体内病毒分布规律的研究

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中国预防兽医学报 2008年第12期30卷 924-928页

作者：危艳武刘长明袁婧黄立平张朝霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

根据发表的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列设计了一对特异引物,并以克隆重组质粒作为阳性标准品,采用SYBR-Green I嵌合荧光染料建立了一种用于检测PCV2的实时定量PCR方法。该方法在107～101范围内具有良好的线性关系,相关系数为R2=0.9... 详细信息

根据发表的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列设计了一对特异引物,并以克隆重组质粒作为阳性标准品,采用SYBR-Green I嵌合荧光染料建立了一种用于检测PCV2的实时定量PCR方法。该方法在107～101范围内具有良好的线性关系,相关系数为R2=0.997,扩增效率为E=0.920;对质粒标准品检测下限值为8.2拷贝/μL,检测变异系数低于2.0%。该方法与常规PCR及过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)比较,其敏感性提高103倍以上。采用该法对PCV2人工感染猪的心、肝、脾、肺、肾、腹股沟淋巴结等组织中病毒核酸载量检测结果表明,在多种脏器中均可检测到病毒,其中腹股沟淋巴结、扁桃体和脾脏中病毒含量较高(为3.4×109拷贝/g～1.7×1010拷贝/g),这表明病毒主要在免疫器官增殖,导致淋巴细胞耗损。对来自国内不同地区的28份临床发病猪病料进行病毒DNA定量检测,有半数以上病料的病毒载量达到109-10拷贝/g。实验表明,实时定量PCR可用于PCV2核酸定量检测,为该病毒体内外定量检测提供了一种技术手段。

关键词：猪圆环病毒2型实时定量PCR 病毒体内分布规律

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致病性猪伪狂犬病病毒PRV-JF株的分离与鉴定

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中国预防兽医学报 2008年第3期30卷 212-215页

作者：张超范刘长明危艳武刘霓虹中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

从临床疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织病料中,经聚合酶链式反应(PCR)证实为猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒感染,采用无PCV1污染的猪肾细胞系(PK-15)分离培养,经蚀斑克隆纯化,培育1株细胞培养适应毒,命名为PRV-JF株。该分离株经细胞培养传代,... 详细信息

从临床疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织病料中,经聚合酶链式反应(PCR)证实为猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒感染,采用无PCV1污染的猪肾细胞系(PK-15)分离培养,经蚀斑克隆纯化,培育1株细胞培养适应毒,命名为PRV-JF株。该分离株经细胞培养传代,能够产生典型的细胞病变,病毒滴度随代次显著增加,第24代毒价达108.5 TCID50/mL。免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测病毒抗原分布在细胞核及细胞质内。病毒感染细胞可被已知PRV阳性血清中和。电镜负染观察到病毒粒子呈椭圆或圆形外观,无囊膜的病毒粒子直径约110 nm～150 nm,有囊膜的成熟病毒粒子直径约150 nm～180 nm。PCR鉴定该毒株含有gE基因,其序列与GenBank登录的7株PRV同源性为97.7%～100%。用不同剂量病毒培养物接种家兔于24 h～72 h内全部死亡。研究表明,PRV-JF分离株对易感动物具有高致病性,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断研究奠定了基础。

关键词：猪伪狂犬病病毒强毒株分离鉴定

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基于重组E2蛋白的猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

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中国兽医科学 2008年第4期38卷 315-319页

作者：孙元夏照和梁冰冰彭伍平仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

根据昆虫细胞密码子偏嗜性,对猪瘟病毒E2基因进行密码子优化,并利用昆虫杆状病毒表达系统进行了表达,表达水平约为野生型E2基因的3倍。将表达的重组E2蛋白纯化后作为ELISA包被抗原,建立了一种基于重组E2蛋白的间接ELISA方法,并对此方法... 详细信息

根据昆虫细胞密码子偏嗜性,对猪瘟病毒E2基因进行密码子优化,并利用昆虫杆状病毒表达系统进行了表达,表达水平约为野生型E2基因的3倍。将表达的重组E2蛋白纯化后作为ELISA包被抗原,建立了一种基于重组E2蛋白的间接ELISA方法,并对此方法的反应条件进行了优化。确定的ELISA最佳条件为:抗原包被浓度为2μg/mL,封闭液为10 g/L聚乙烯醇PBS溶液,被检血清1∶160稀释,辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG(二抗)1∶5 000稀释。确定的阴性血清临界D450 nm值为0.30,阳性血清临界D450 nm值为0.35。将该ELISA方法与IDEXX公司生产的猪瘟病毒抗体检测试剂盒做相关比较,结果符合率为82.3%。表明,该方法可以用于猪瘟病毒抗体的检测。

关键词：猪瘟病毒 E2蛋白密码子优化杆状病毒表达系统间接ELISA

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猪圆环病毒1型感染性克隆的构建与病毒拯救

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中国预防兽医学报 2008年第3期30卷 161-165页

作者：刘长明危艳武陆月华张朝霞袁婧黄立平中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

用PCR法扩增猪圆环病毒1型(PCV1)全长基因组,将2个基因组顺式连接插入到pUC19质粒载体中构建感染性分子克隆。通过引物设计替换碱基,在病毒基因组内插入SalⅠ酶切位点作为分子靶标,拯救出带有分子标记的克隆病毒,命名为recPCV1/G株。通... 详细信息

用PCR法扩增猪圆环病毒1型(PCV1)全长基因组,将2个基因组顺式连接插入到pUC19质粒载体中构建感染性分子克隆。通过引物设计替换碱基,在病毒基因组内插入SalⅠ酶切位点作为分子靶标,拯救出带有分子标记的克隆病毒,命名为recPCV1/G株。通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)在病毒感染细胞中检出病毒抗原,其抗原性仅与PCV1/Cap蛋白单价特异性抗体发生反应,而与抗PCV2/Cap蛋白抗体无交叉。克隆毒株基因组内插入一个SalⅠ酶切位点,可用PCR结合限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)与亲本病毒相鉴别。该毒株经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定,病毒滴度达104.8 TCID50/mL。构建的PCV1感染性克隆,为今后开展该病毒的起源与演化、遗传变异规律、分子鉴别诊断等研究奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒1型感染性克隆病毒拯救

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果子狸源呼肠孤病毒的分离鉴定

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病毒学报 2008年第5期24卷 376-382页

作者：邵昱昊韩宗玺陈露菲孔宪刚刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 黑龙江省疾病预防控制中心哈尔滨150030

在广东省采集的果子狸样品共192份,处理后接种Vero-E6细胞,从中分离到1株病毒。该病毒在Vero-E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变,表现为细胞内颗粒增多,细胞收缩、变圆,最后细胞从瓶壁脱落。经电镜观察发现,病毒粒子无囊膜,有双层衣... 详细信息

在广东省采集的果子狸样品共192份,处理后接种Vero-E6细胞,从中分离到1株病毒。该病毒在Vero-E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变,表现为细胞内颗粒增多,细胞收缩、变圆,最后细胞从瓶壁脱落。经电镜观察发现,病毒粒子无囊膜,有双层衣壳,呈正二十面体对称,具有呼肠孤病毒的形态特征,将病毒命名为MaskedPal m Civet/China/2004(MPC/04)。红细胞凝集试验表明该病毒能凝集健康人O型血红细胞,不能凝集SPF鸡、实验用普通级牛、大鼠和豚鼠的红细胞,这与哺乳动物呼肠孤病毒血清1型的红细胞凝集谱相符。理化特性试验表明该病毒对氯仿有抵抗力;能耐受pH3.0的酸性环境;50℃水浴1h病毒未丧失感染能力;1mol/L MgCl2能提高病毒对热的抵抗力。为了进一步从分子水平上证实该病毒是呼肠孤病毒,用哺乳动物呼肠孤病毒特异性引物进行反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR),扩增得到了预期大小的片段。测序结果经NCBI BLAST比较,选取同源性较高者进行序列同源性分析,发现该片段与哺乳动物呼肠孤病毒血清1型参考毒株核苷酸同源性最高。以上结果证明该病毒为呼肠孤病毒科的成员。

关键词：果子狸呼肠孤病毒分离鉴定

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逆转录病毒基因组RNA的二聚作用

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病毒学报 2008年第6期24卷 487-491页

作者：高旭沈荣显相文华周建华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室大动物传染病研究室哈尔滨150001 延边大学农学院动物医学系延吉133400

逆转录病毒科(Retroviridae)是一成员众多、易变异的RNA病毒科。在逆转录病毒复制周期内,所有逆转录病毒均将两拷贝的单股正链RNA带人病毒粒子。在此过程中,遗传物质——基因组RNA能顺利包装入病毒粒子是病毒复制与繁衍的关键,而基因组... 详细信息

逆转录病毒科(Retroviridae)是一成员众多、易变异的RNA病毒科。在逆转录病毒复制周期内,所有逆转录病毒均将两拷贝的单股正链RNA带人病毒粒子。在此过程中,遗传物质——基因组RNA能顺利包装入病毒粒子是病毒复制与繁衍的关键,而基因组RNA通过二聚作用(Dimerization)形成二聚体(Dimer)是包装逆转录病毒的前提。[第一段]

关键词：逆转录病毒科 RNA病毒病毒基因组二聚作用病毒复制病毒粒子遗传物质二聚体

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抗菌肽在宿主防御中的作用

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中国生物工程杂志 2008年第4期28卷 82-86页

作者：史春林王云峰石星明王玫孙妍童光志东北农业大学生研究生学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001 中国农业科学院上海兽医研究所上海200232

抗菌肽广泛地存在于自然界中,其中许多抗菌肽具有直接抗微生物活性,能作用于G-,G+细菌、真菌、寄生虫甚至是包膜病毒,并且在宿主先天免疫和适应性反应中有重要的调节作用。近来,越来越多的证据表明抗菌肽是有效的免疫辅助因子,能够与其... 详细信息

抗菌肽广泛地存在于自然界中,其中许多抗菌肽具有直接抗微生物活性,能作用于G-,G+细菌、真菌、寄生虫甚至是包膜病毒,并且在宿主先天免疫和适应性反应中有重要的调节作用。近来,越来越多的证据表明抗菌肽是有效的免疫辅助因子,能够与其他的众多免疫效应子协同作用,从而起始适应性免疫,促进伤口愈合,抑制前炎症反应以及诱导和调节细胞因子和趋化因子的产生。另外,随着抗菌肽作用机理逐渐被揭开,将这些内源性肽及其衍生物制成抗感染治疗药剂将会有广阔的应用前景。

关键词：先天免疫宿主防御抗茵肽

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鸡法氏囊B淋巴细胞三框cDNA表达文库的构建

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中国预防兽医学报 2008年第1期30卷 10-13页

作者：高玉龙刘伟高宏雷邓小芸李铁强王笑梅沈荣显中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学黑龙江哈尔滨150030

分离纯化3周龄SPF鸡法氏囊B淋巴细胞的mRNA,以5'端生物素标记的Oligo(dT)primer为引物反转录后连接3种读码框的Adapter,层析柱分级纯化,通过BP重组反应分别构建3种读码框的cDNA入门文库,平均滴度分别为1×105CFU/mL、1×105... 详细信息

分离纯化3周龄SPF鸡法氏囊B淋巴细胞的mRNA,以5'端生物素标记的Oligo(dT)primer为引物反转录后连接3种读码框的Adapter,层析柱分级纯化,通过BP重组反应分别构建3种读码框的cDNA入门文库,平均滴度分别为1×105CFU/mL、1×105CFU/mL、1.2×105CFU/mL,文库总容量分别为1.2×106CFU、1.2×106CFU、1.5×106CFU,平均插入片段分别为1270bp、1190bp和1120bp,阳性重组率均为100%。将3种读码框的cDNA入门文库扩增后提取质粒,取等量的质粒通过LR重组反应将入门文库转换为三框表达文库,经测定平均滴度为1×105CFU/mL,文库总容量为1.2×106CFU,平均插入片段为1017bp,阳性重组率为100%。结果表明所构建的三框cDNA表达文库具有较高的重组率和较大的库容量,为进一步筛选鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)在法氏囊B淋巴细胞中的受体及研究细胞嗜性奠定了基础。

关键词：三框cDNA文库 cDNA表达文库法氏囊 B淋巴细胞传染性法氏囊病毒(IBDV)

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