检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：戚亭崔尚金张超范中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室

利用PCR技术扩增PPV LXB-PPV020-06株NS1基因全序列,将目的基因与原核表达载体pET=32a(+)进行连接并转化,重组质粒经PCR和双酶切鉴定并测序。测序结果表明,目的基因正确地插入到重组质粒当中。通过对表达宿主菌的选择,PPVLXB-PPV-20-06... 详细信息

利用PCR技术扩增PPV LXB-PPV020-06株NS1基因全序列,将目的基因与原核表达载体pET=32a(+)进行连接并转化,重组质粒经PCR和双酶切鉴定并测序。测序结果表明,目的基因正确地插入到重组质粒当中。通过对表达宿主菌的选择,PPVLXB-PPV-20-06株NS1基因在Rosetta(DE)plysS菌中的到良好的表达,并确定了NS1基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.6mmol/L、诱导时间为3.5h、诱导温度为37℃。表达产物经SDS-PAGE分析,得到分子量约为97kDa的重组蛋白,除了包涵体形式表达外,一部分重组蛋白以可溶性形式表达。重组蛋白经Western blot检测,可与PPV阳性血清反应。这为NS1蛋白在临床诊断中的应用打下基础。

关键词：猪细小病毒LXB-PPV-20-06株 NS1基因原核表达鉴定

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猪圆环病毒1型血清抗体IPMA检测方法的建立及其应用

猪圆环病毒1型血清抗体IPMA检测方法的建立及其应用

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：黄立平刘长明危艳武张朝霞陆月华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

本研究建立了一种免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)用于猪圆环病毒1型(PCV1)血清抗体的检测。对IPMA抗原反应板的制备、被检血清稀释倍数、酶标抗体及底物显色液等进行了系统试验。用IPMA法对已知PCV1和PCV2参考阳性血清进行试验表明,... 详细信息

本研究建立了一种免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)用于猪圆环病毒1型(PCV1)血清抗体的检测。对IPMA抗原反应板的制备、被检血清稀释倍数、酶标抗体及底物显色液等进行了系统试验。用IPMA法对已知PCV1和PCV2参考阳性血清进行试验表明,血清稀释倍数≥1:100可消除两种病毒间存在的低水平交叉反应。该方法与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA检测符合率为88.9%,与其它几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应。对来自黑龙江、吉林、河北、上海、辽宁等地猪场送检的257份血清样品进行检测,PCV1和PCV2血清抗体阳性检出率分别为19.1%、80.5%。PCV1抗体阳性猪中有95.9%为PCV2阳性,表明我国猪群已存在PCV1感染,在临床上PCV1与PCV2多以混合感染形式存在。本研究建立的PCV1-IPMA方法具有操作简便、特异和敏感等特点,可为PCV1流行病学调查及血清抗体检测提供了一种技术手段。

关键词：猪圆环病毒1型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测

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猪圆环病毒2型灭活疫苗的研制

猪圆环病毒2型灭活疫苗的研制

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会

作者：刘长明危艳武中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的重要病原,以进行性消瘦、咳嗽、呼吸困难、腹泻、皮肤苍白、淋巴结肿大、肾脏灰白水肿为主要特征,给养猪业造成了巨大的经济损失。此外,猪皮炎与肾炎综合征（PNDS）、猪... 详细信息

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的重要病原,以进行性消瘦、咳嗽、呼吸困难、腹泻、皮肤苍白、淋巴结肿大、肾脏灰白水肿为主要特征,给养猪业造成了巨大的经济损失。此外,猪皮炎与肾炎综合征（PNDS）、猪繁殖障碍（PRF）、猪呼吸道疾病复合征（PRDC）、猪的间质性肺炎及先天性震颤（CT）等疾病也与PCV2感染相关,现统称为猪圆环病毒病（PCVD）。在PCV2疫苗研制过程中,遇到的主要问题有:该病毒体外繁殖能力差,培养物病毒含量低;病毒接种细胞不产生病变,病毒含量不易测定;病毒感染动物临床反应不一,免疫效力评价困难。本研究采用临床分离的PCV2毒株,通过细胞培养传代,获得细胞培养适应毒株,病毒繁殖能力也随病毒传代毒价显著提高,实验室制备了5批次病毒液滴度达10TCID50/ml,具备了疫苗种毒的条件。按现行《中国兽药典》标准对疫苗毒种进行了细菌、霉菌、支原体及其他外源病毒检验均符合规定要求。PCV2培养液经甲醛灭活后,用5种佐剂乳化制备灭活疫苗,经动物免疫试验比较确定了疫苗制造规程。用实验室制备的5批次疫苗对本动物进行了单剂量、单剂量重复和大剂量安全性试验,证明疫苗安全性良好,无毒副作用。用本动物进行的攻毒试验结果表明,该疫苗免疫保护率达96%。该疫苗主要用于预防PCV2感染引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征,适用于3周龄以上猪只使用。免疫程序为仔猪断奶前1周进行首次免疫,间隔3周加强免疫1次,剂量均1ml/头;成猪每半年免疫1次,剂量为2ml/头;母猪配种前免疫1次,产前20日加强免疫1次,剂量均为2ml/头。该疫苗于2-8℃下保存,有效期为12个月,免疫持续期为6个月。目前该疫苗已完成实验室研究,进入临床试验阶段。

关键词：猪圆环病毒灭活疫苗研制

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基于CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立

基于CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：赵和平孙元袁远仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

本研究旨在建立一种方便可靠的评价猪只细胞免疫水平的试验方法。用终浓度分别为3μg/mL、6μg/mL、9μg/mL和12μg/mL的刀豆素A(ConA)刺激经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色的猪外周血单个核细胞(PBMC)3d、5d和7d,然后用荧... 详细信息

本研究旨在建立一种方便可靠的评价猪只细胞免疫水平的试验方法。用终浓度分别为3μg/mL、6μg/mL、9μg/mL和12μg/mL的刀豆素A(ConA)刺激经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色的猪外周血单个核细胞(PBMC)3d、5d和7d,然后用荧光标记的单克隆抗体对CD4+和CD8+细胞进行标记,最后利用流式细胞术分析。结果表明,不同浓度ConA刺激后,猪PBMC增殖能力不同,ConA浓度为6μg/mL时CD4+和CD8+细胞的细胞分裂指数最大,用MTT试验也获得相似结果。对PBMC刺激5d后进行分析相对较好。本研究建立了一种基于活细胞染料CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法,该方法可以在单个细胞水平上有效地分析刺激后CD4+和CD8+细胞亚群的增殖水平,进而评价细胞免疫水平。

关键词：猪淋巴细胞细胞免疫 CFSE染色淋巴细胞增殖试验

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猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会

作者：张朝霞刘长明危艳武袁婧黄立平中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

利用纯化的重组杆状病毒表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白作为检测抗原,建立一种间接ELISA方法用于血清抗体检测.昆虫细胞株(Sf-21)接种重组杆状病毒,对蛋白表达参数及纯化工艺进行了优化。制备了5批重组蛋白抗原,表达量占总蛋白的18.7%... 详细信息

利用纯化的重组杆状病毒表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白作为检测抗原,建立一种间接ELISA方法用于血清抗体检测.昆虫细胞株(Sf-21)接种重组杆状病毒,对蛋白表达参数及纯化工艺进行了优化。制备了5批重组蛋白抗原,表达量占总蛋白的18.7%左右;Ni2+亲和层析柱纯化获得重组蛋白纯度为90.1%;重组蛋白可被特异性抗体识别,具有良好的免疫活性。用建立的ELISA法对30份已知阴性血清样本检测临界OD405nm值为0.343;ELISA与IPMA对150份血清进行平行检测符合率为95.3%(143/150),特异性为91.2%(31/34),敏感性为96.5% (112/116);与其他几种常见猪病毒参考血清无交叉。组装的试剂盒批内和批间变异系数分别为4.0%～4.8%和8.9%～9.9%;置-20℃保存12个月稳定。试剂盒对人工感染猪血清检测结果,接种后第5周抗体阳转,第8～9周抗体水平达到高峰;对来自黑龙江、吉林、河北、上海等地猪场1085份血清抗体检测,阳性率为73.6%。研制的ELISA试剂盒为临床PCV2血清抗体检测及疫苗免疫效果的评价提供了技术手段。

关键词：猪圆环病毒2型重组蛋白间接ELISA 抗体检测试剂盒

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猪流行性腹泻病毒S蛋白中和表位区单克隆抗体的制备与鉴定

猪流行性腹泻病毒S蛋白中和表位区单克隆抗体的制备与鉴定

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：孙东波冯力时洪艳陈建飞崔晓辰佟有恩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

以纯化的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白中和表位(S1D)重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术获得了6株稳定分泌抗S1D区特异性的单克隆抗体细胞株,分别命名为2C4、3G3、5F8、3G5、6E6和3C... 详细信息

以纯化的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白中和表位(S1D)重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术获得了6株稳定分泌抗S1D区特异性的单克隆抗体细胞株,分别命名为2C4、3G3、5F8、3G5、6E6和3C3。6株杂交瘤细胞诱生小鼠产生的腹水抗体效价分别为1:51200、1:6400、1:12800、1:6400、1:51200和1:25600。免疫球蛋白类型均为IgG1型,轻链均为κ链。Western blot试验结果显示,6株单克隆抗体均能特异性地识别天然PEDV中的S蛋白。

关键词：猪流行性腹泻病毒 S蛋白中和表位区单克隆抗体

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猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株S基因的克隆、序列分析及线性抗原表位区的鉴定

猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株S基因的克隆、序列分析及线性抗原表位...

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：孙东波冯力陈建飞时洪艳佟有恩刘胜旺陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

以猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得的3个相互重叠的cDNA克隆覆盖了S基因,序列比对结果表明:PEDV CH/JL株S基因与CV777、Brl/87、JS、KPEDV和Chinju99毒株S基因核苷酸序列的同源性分别为96～97%、96～87%、96～... 详细信息

以猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得的3个相互重叠的cDNA克隆覆盖了S基因,序列比对结果表明:PEDV CH/JL株S基因与CV777、Brl/87、JS、KPEDV和Chinju99毒株S基因核苷酸序列的同源性分别为96～97%、96～87%、96～41%、94～02%和93～93%,氨基酸序列的同源性分别为96.17%、95.88%、96.10%、92.36%和92.05%;分子进化树分析结果显示,PEDV CH/JL株S基因与JS毒株S基因亲缘关系最近,处于同一群。利用DNAstar Protean程序预测了PEDV CH/JL株S蛋白一个抗原表位区(83～276aa),将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1后转化*** BL21(DE3)感受态细胞,在终浓度110mmol/L的IPTG诱导下获得了表达,Western blot结果显示,预测的抗原表位区GST融合蛋白能与猪流行性腹泻病毒多克隆抗血清反应,提示该抗原表位区含有线性抗原表位。

关键词：猪流行性腹泻病毒 S基因序列分析线性抗原表位区

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猪细小病毒的分子生物学研究

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猪业科学 2008年第2期25卷 22-24页

作者：崔尚金戚亭中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病学研究室黑龙江哈尔滨100051

猪细小病毒病是由猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）感染所引起的猪的重要传染病之一。该病的主要特征为受感染的母猪，特别是初产母猪及血清学阴性经产母猪发生流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等。该病广泛存在于世... 详细信息

猪细小病毒病是由猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）感染所引起的猪的重要传染病之一。该病的主要特征为受感染的母猪，特别是初产母猪及血清学阴性经产母猪发生流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等。该病广泛存在于世界各地并在大多数猪场呈地方性流行，严重地影响着养猪业的发展，该病的严重危害及该病病原独特的生物学特性受到了国内外许多学者的关注。

关键词：猪细小病毒病分子生物学经产母猪生物学特性初产母猪传染病血清学木乃伊

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猪圆环病毒2型分子标记毒株的构建及生物学特性研究

猪圆环病毒2型分子标记毒株的构建及生物学特性研究

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会

作者：刘长明危艳武张超范谭斌陆月华孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

以临床分离的猪圆环病毒2型(PCV2)为材料,利用PCR法扩增病毒基因组,将2个基因组顺式连接插入到质粒载体中构建感染性分子克隆。通过引物设计替换碱基,在病毒基因组内插入SalⅠ制性内切酶位点作为遗传标记,经重组质粒转染细胞获得带有遗... 详细信息

以临床分离的猪圆环病毒2型(PCV2)为材料,利用PCR法扩增病毒基因组,将2个基因组顺式连接插入到质粒载体中构建感染性分子克隆。通过引物设计替换碱基,在病毒基因组内插入SalⅠ制性内切酶位点作为遗传标记,经重组质粒转染细胞获得带有遗传标记的新毒株。采用免疫过氧化物酶单层细胞试验、免疫电镜、核酸序列分析表明,在病毒感染细胞中检出病毒特异抗原,其抗原性、病毒形态学及基因序列与亲本毒株一致。鉴于新病毒基因组内插入一个SalⅠ酶切位点,可用限制性片断长度多态性分析法可与野生型病毒相鉴别。新毒株经细胞连续传80代,体外培养增殖性能稳定,毒价可达107.0TCID50/mL。取第60代病毒培养物经肌肉和滴鼻途径接种35日龄抗体阴性仔猪4头,接种后表现出体温升高、进行性消瘦、被毛粗糙及体表淋巴结肿胀症状,迫杀后多种脏器中均能检测到病毒抗原与核酸。研究表明,利用感染性分子克隆手段构建带有遗传标记的PCV2新毒株,为进一步开展该病毒的致病性、疫苗免疫、分子诊断等研究奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型遗传标记病毒生物学特性

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实时定量PCR对猪圆环病毒2型感染猪体内病毒分布规律的研究

实时定量PCR对猪圆环病毒2型感染猪体内病毒分布规律的研究

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会

作者：危艳武刘长明袁婧黄立平张朝霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室

根据发表的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列设计了一对特异引物,并以克隆重组质粒作为阳性标准品,采用SYBR-GreenⅠ嵌合荧光染料建立了一种用于检测PCV2的实时定量PCR方法。该方法在107-101范围内具有良好的线性关系,相关系数R2=0.9... 详细信息

根据发表的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列设计了一对特异引物,并以克隆重组质粒作为阳性标准品,采用SYBR-GreenⅠ嵌合荧光染料建立了一种用于检测PCV2的实时定量PCR方法。该方法在107-101范围内具有良好的线性关系,相关系数R2=0.997,扩增效率E=0.920,对质粒标准品检测下限值为8.2拷贝/μL,检测变异系数低于2.0%;该方法与常规PCR及过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）,其敏感性提高10～3倍以上。用本法对PCV2人工感染猪心、肝、脾、肺、肾、腹股沟淋巴结等组织中病毒核酸载量检测结果表明,多种脏器均可检测到病毒,但以腹股沟淋巴结、扁桃体和脾脏中病毒含量较高,表明病毒主要在免疫器官增殖,导致淋巴细胞耗损。用实时定量PCR对来自国内不同地区的28份临床发病猪病料进行病毒DNA定量检测,有半数以上病例病毒载量持在10拷贝/g数量级.实时定量PCR可用于PCV2核酸定量检测,为该病毒体内外定量检测提供了一种技术手段。

关键词：猪圆环病毒2型实时定量PCR 病毒体内分布规律

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