检索结果-内蒙古大学图书馆

微生物学报 2009年第6期49卷 813-819页

作者：杜金玲刘明刘春国杨涛李洪涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001

【目的】为研究流感病毒突破种间屏障分子机制,筛选流感基因工程疫苗株。【方法】本试验以猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)为亲本株,利用反向遗传学操作技术,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体p... 详细信息

【目的】为研究流感病毒突破种间屏障分子机制,筛选流感基因工程疫苗株。【方法】本试验以猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)为亲本株,利用反向遗传学操作技术,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接,重组质粒转染293T和MDCK共培养细胞,拯救出全部基因均来自于亲本株的猪流感病毒rgH3N2,并分别以人流感病毒A/PR/8/34(H1N1)、禽流感病毒A/Duck/Nanchang/4-165/2000(H4N6)、马流感病毒A/Equine/Fuyun/2008/(H3N8)的HA和NA基因替换A/Swine/Henan/S4/01的相应基因。【结果】生物学试验结果表明rgH3N2在鸡胚半数感染量、组织培养半数感染量、稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。rgH3N2经鸡胚多次传代后血凝价最高可达到1∶256,接种MDCK细胞60h后,血凝价可以达到1∶64。基因替换后成功拯救出的重组病毒rgH1N1、rgH4N6和rgH3N8在鸡胚和细胞上均具有较高的增殖能力。【结论】病毒的成功拯救为流感病毒突破种间屏障分子机制,HA、NA基因在流感病毒跨种属传播中所扮演角色的研究和流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。

关键词：猪流感反向遗传 RT-PCR H3N2亚型病毒拯救

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一株鹅源H5N2亚型高致病性禽流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析

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生物化学与生物物理进展 2009年第1期36卷 65-71页

作者：刘春国刘明张云刘大飞潘蔚绮孙恩成杜金玲李洪涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感中心及国家禽流感参考实验室哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病实验室哈尔滨150001 中国科学院广州生物医药与健康研究院广州510663 黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆163319 东北农业大学动物医学院哈尔滨150030

分离到一株鹅源H5N2亚型高致病性禽流感病毒,SPF鸡静脉接种致病指数为2.99,但鸭子对该病毒不敏感.病毒感染小鼠后不致病,但能够在肺内有效复制,表明其具有感染哺乳动物的潜在风险.血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白裂解位点上插入有多个连... 详细信息

分离到一株鹅源H5N2亚型高致病性禽流感病毒,SPF鸡静脉接种致病指数为2.99,但鸭子对该病毒不敏感.病毒感染小鼠后不致病,但能够在肺内有效复制,表明其具有感染哺乳动物的潜在风险.血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白裂解位点上插入有多个连续的碱性氨基酸(-RRRKKR-),从分子上证实这是一株高致病性禽流感病毒.核酸序列比较分析表明,分离的流感病毒HA基因与A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)同源率达到99.4%,神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因与A/chicken/Jilin/53/01(H9N2)同源率达到99.8%;氨基酸水平上,HA与2004年分离到的A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)、A/swan/Guangxi/307/2004(H5N1)、A/wildduck/Guangdong/314/2004(H5N1)和A/chicken/Henan/210/2004(H5N1)同源率均为99.3%,NA与A/chicken/Jilin/53/01(H9N2)同源率为99.6%.进化树分析结果表明,该流感病毒分离株可能是由H5N1和H9N2两个亚型病毒重排而来.

关键词：鹅禽流感病毒 H5N2亚型致病性序列分析

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E2蛋白介导猪瘟病毒的细胞吸附与内化

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中国农业科学 2018年第10期51卷 1995-2003页

作者：尹彩霞于少雄宋琨李素杨玉莹仇华吉长江大学动物科学学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室

【目的】已有研究显示,猪瘟病毒(CSFV)通过网格蛋白介导的内吞作用侵入宿主细胞,然而参与侵入过程的病毒蛋白尚待阐明。研究旨在明确E2蛋白在CSFV侵入过程中的作用。【方法】通过瞬时转染包装携带E2基因的慢病毒,将慢病毒转导悬浮293细... 详细信息

【目的】已有研究显示,猪瘟病毒(CSFV)通过网格蛋白介导的内吞作用侵入宿主细胞,然而参与侵入过程的病毒蛋白尚待阐明。研究旨在明确E2蛋白在CSFV侵入过程中的作用。【方法】通过瞬时转染包装携带E2基因的慢病毒,将慢病毒转导悬浮293细胞构建稳定表达重组E2蛋白的悬浮293细胞系,利用亲和层析的方法纯化重组E2蛋白,同时优化表达时间以增加蛋白产量。利用SDS-PAGE和Western blotting分别鉴定了重组E2蛋白的表达水平及其反应原性。通过感染试验、吸附试验以及内化试验分别探究了E2蛋白对CSFV感染、吸附以及内化的影响。将重组E2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过阻断ELISA检测血清中多克隆抗体的阻断率。利用制备的多克隆抗体与CSFV感作后进行吸附和内化试验,进一步探究了E2蛋白在介导CSFV吸附和内化中的作用。【结果】通过倒置荧光显微镜观察转导慢病毒后的细胞系,与对照细胞相比可见明显的绿色荧光,表明慢病毒成功转导悬浮293细胞。SDS-PAGE结果显示,在还原和非还原条件下均出现与预期大小相符的蛋白条带,经Western blotting验证,上清中表达的重组E2蛋白能够被抗E2蛋白单克隆抗体WH303所识别,表明构建的悬浮293细胞系能够表达重组E2蛋白。通过优化表达条件,悬浮293细胞培养第8天时上清中重组E2蛋白浓度最高可达5.84μg·m L-1。可溶性蛋白阻断试验结果显示,重组E2蛋白具有阻断CSFV感染的活性。利用重组E2蛋白在病毒入侵过程中处理细胞对CSFV的感染同样具有显著抑制作用;阻断ELISA和中和试验结果显示,针对E2蛋白的多克隆抗体能够阻断CSFV感染,且具有良好的中和活性;吸附试验和内化试验证明,重组E2蛋白处理细胞能够显著抑制CSFV的内化,而利用多克隆抗体与CSFV感作后能够显著抑制其吸附。【结论】E2蛋白参与CSFV吸附和内化。

关键词：猪瘟病毒 E2蛋白悬浮细胞系吸附内化

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禽网状内皮组织增生病病毒gp90全长蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性分析

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微生物学报 2009年第10期49卷 1380-1384页

作者：高立祁小乐高宏雷高玉龙秦立廷孙芬芬张云王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

【目的】原核表达免疫原性良好的禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)gp90蛋白,并制备抗gp90蛋白高效价多克隆血清。【方法】利用PCR技术,以pMD18T-env为模板,扩增得到REV的gp90蛋白编码基因,将其克隆入表达载体... 详细信息

【目的】原核表达免疫原性良好的禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)gp90蛋白,并制备抗gp90蛋白高效价多克隆血清。【方法】利用PCR技术,以pMD18T-env为模板,扩增得到REV的gp90蛋白编码基因,将其克隆入表达载体pET-28a(+)中,将构建的原核表达质粒pET28-gp90,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后进行gp90蛋白表达并鉴定。用纯化的gp90蛋白免疫6-8周龄Balb/c小鼠,制备抗gp90的多克隆血清。用间接免疫荧光试验检测该血清的特异性,用酶联免疫吸附试验(ELISA)滴定其效价。【结果】REV gp90基因在重组大肠杆菌中正确表达,免疫小鼠后获得的抗血清可与重组杆状病毒表达的gp90蛋白特异性反应,ELISA效价达到1∶12800,该研究为开展REV诊断试剂的研制奠定了基础。

关键词：禽网状内皮组织增生病病毒 gp90蛋白原核表达纯化多克隆抗体

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鸡传染性法氏囊病病毒Gt株VP5基因缺失株感染性克隆的构建

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微生物学报 2008年第12期48卷 1666-1670页

作者：秦立廷祁小乐高玉龙高宏雷步志高王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001

传染性法氏囊病病毒(IBDV)是双链,双节段RNA病毒,其基因组由A、B两个节段组成,编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术,缺失IBDV Gt株VP5基因,通过多... 详细信息

传染性法氏囊病病毒(IBDV)是双链,双节段RNA病毒,其基因组由A、B两个节段组成,编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术,缺失IBDV Gt株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGG的β肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGmGtAΔVP5HRT,将该感染性克隆与pCAGGmGtBHRT共转染DFⅠ细胞。【结果】RT-PCR和间接免疫荧光均显示获得重组病毒,将其命名为rmGtAΔVP5。IBDV VP5基因缺失感染性克隆的成功构建为从分子水平上深入研究vp5基因功能奠定了基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒 VP5 感染性克隆重组病毒

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猪瘟病毒石门强毒株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白糖基化位点差异分析

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病毒学报 2007年第5期23卷 389-393页

作者：彭伍平夏照和侯强李娜孙元童光志仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株E2糖蛋白分别含有5个和6个潜在的糖基化位点,其中986N是兔化弱毒疫苗株所特有的。为了分析二者糖基化位点差异及其影响,将去掉信号肽和跨膜区的猪瘟病毒石门强毒株(Shi-men)和兔化弱毒疫苗株(HCLV)E2基... 详细信息

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株E2糖蛋白分别含有5个和6个潜在的糖基化位点,其中986N是兔化弱毒疫苗株所特有的。为了分析二者糖基化位点差异及其影响,将去掉信号肽和跨膜区的猪瘟病毒石门强毒株(Shi-men)和兔化弱毒疫苗株(HCLV)E2基因置于蜂素信号肽序列下游,使其在Sf9细胞内表达重组Shimen-E2和HCLV-E2蛋白。结果显示,重组E2蛋白以二聚体的形式分泌表达于细胞培养液中,但二者分子量存在差异。用endo H和PNGase F对纯化后的重组E2蛋白进行去糖基化处理后,二者分子量大小变成一致,证实石门强毒株和兔化弱毒株E2蛋白分子量大小的差异可能是由于糖基化程度的差异所致。对986N糖基化位点进行定点突变后发现,突变后的Shimen-E2与野生型HCLV-E2分子量大小一致,而突变后的HCLV-E2与野生型Shimen-E2分子量大小一致,表明Shimen-E2和HCLV-E2分子量大小的差异的确是由于986N糖基化位点的差异引起的。

关键词：猪瘟病毒 E2囊膜糖蛋白糖基化位点杆状病毒表达系统蜂素信号肽

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猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析

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微生物学报 2011年第5期51卷 643-647页

作者：吕茂杰陈建飞时洪艳陈小金范秀萍申识川冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

【目的】阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白与病毒感染细胞核仁成分B23.1蛋白的共定位特征。【方法】分别参照GenBank中PEDV CV777株的N基因序列(AF353511)和编码人细胞核仁蛋白B23.1基因序列(BC050628.1),设计、合成扩增N基因和B2... 详细信息

【目的】阐明猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白与病毒感染细胞核仁成分B23.1蛋白的共定位特征。【方法】分别参照GenBank中PEDV CV777株的N基因序列(AF353511)和编码人细胞核仁蛋白B23.1基因序列(BC050628.1),设计、合成扩增N基因和B23.1基因的引物,利用RT-PCR技术扩增了N基因和Vero E6细胞的B23.1基因的cDNA,分别克隆到真核表达载体pAcGFP1-C1和pDsRed2-N1,获得重组质粒pAcGFP1-C1/N和pDsRed2-N1/B23.1,共转染Vero E6细胞。【结果】Western blots分析表明这些融合蛋白在转染的Vero E6细胞中表达;共聚焦显微镜技术分析表明在共转染Vero E6细胞中猪流行性腹泻病毒N蛋白与Vero E6细胞核磷蛋白B23.1发生共定位。【结论】为进一步鉴定PEDV N蛋白中核仁定位信号和N蛋白核仁定位机制提供可靠依据。

关键词：猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白核磷蛋白B23.1 共定位

来源：评论

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表达鸡γ-干扰素和传染性支气管病毒S1基因的重组鸡痘病毒疫苗对鸡外周血T淋巴细胞动态分布影响的研究

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中国预防兽医学报 2006年第5期28卷 539-543页

作者：孙永科田占成王云峰刘胜旺童光志智海东王玫中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

机体的免疫应答是一个复杂的生物学过程,它以体液和细胞免疫为主,二者相互影响,相互作用,而构成了一个动态整体。本研究通过FACS技术检测SPF鸡接种共表达IBVS1基因和鸡γ-干扰素基因的重组鸡痘病毒疫苗后外周血中CD4+、CD8+和TCRδγ+... 详细信息

机体的免疫应答是一个复杂的生物学过程,它以体液和细胞免疫为主,二者相互影响,相互作用,而构成了一个动态整体。本研究通过FACS技术检测SPF鸡接种共表达IBVS1基因和鸡γ-干扰素基因的重组鸡痘病毒疫苗后外周血中CD4+、CD8+和TCRδγ+三种亚类T淋巴细胞的数量的变化,初步探讨了干扰素对鸡外周血中T淋巴细胞亚类动态分布的影响。结果表明,含有干扰素基因的重组鸡痘病毒能显著增高机体特异性的CD8+和TCRδγ+T淋巴细胞水平,CD4+T淋巴细胞比例则要低于其他的疫苗免疫组。

关键词： T淋巴细胞鸡γ-干扰素传染性支气管病毒重组鸡痘病毒

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重组痘病毒表达裂谷热病毒囊膜蛋白及其免疫原性分析

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中国预防兽医学报 2007年第6期29卷 409-413页

作者：王清华胡森王喜军步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

裂谷热(Rift valley fever,RVF)是由裂谷热病毒(Rift valley fever virus,RVFV)引起的烈性人畜共患传染病。囊膜糖蛋白G是病毒的主要结构蛋白,由基因组M节段编码,翻译后裂解为Gn和Gc,其中Gn为诱导中和抗体的主要免疫原。本研究分别构建... 详细信息

裂谷热(Rift valley fever,RVF)是由裂谷热病毒(Rift valley fever virus,RVFV)引起的烈性人畜共患传染病。囊膜糖蛋白G是病毒的主要结构蛋白,由基因组M节段编码,翻译后裂解为Gn和Gc,其中Gn为诱导中和抗体的主要免疫原。本研究分别构建了表达RVFV囊膜蛋白G(n+c)和Gn的重组痘病毒rVV-G (n+c)和rVV-Gn。SDS-PAGE、Western blot结果表明分子量分别为56 Ku(Gn)、58 Ku(Gc)左右的重组蛋白在rVV-G(n+c)和rVV-Gn哺乳动物细胞获得准确表达[G(n+c)裂解为Gn和Gc],并具有特异免疫反应原性。以rBac-G(n+c)和rBac-Gn感染的昆虫细胞裂解物为包被抗原,间接ELISA检测血清抗体结果显示,rVV-G (n+c)和rVV-Gn免疫小鼠可诱导显著的Gn、Gc特异抗体反应,并且rVV-G(n+c)免疫诱导主要保护性免疫原Gn特异抗体反应效果优于rVV-Gn。结果表明,表达全长囊膜糖蛋白重组痘病毒rG(n+c)具有作为安全有效的重组病毒活载体疫苗的潜力,为RVF重组亚单位疫苗的探索研究奠定了基础。

关键词：裂谷热病毒囊膜蛋白重组痘病毒 ELISA

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鸭肠炎病毒UL51和UL52基因的克隆及序列分析

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中国预防兽医学报 2008年第9期30卷 689-693页

作者：李阳安瑞李慧昕韩宗玺邵昱昊刘胜旺孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

利用靶基因步行PCR方法扩增得到鸭肠炎病毒(DEV Clone-03)5352bp基因片段,并进行克隆和测序。序列分析发现,该片段包含2个ORF。Blast分析表明,这2个ORF分别与单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL51和UL52基因同源,命名为DEV Clone-03UL51和UL52,... 详细信息

利用靶基因步行PCR方法扩增得到鸭肠炎病毒(DEV Clone-03)5352bp基因片段,并进行克隆和测序。序列分析发现,该片段包含2个ORF。Blast分析表明,这2个ORF分别与单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL51和UL52基因同源,命名为DEV Clone-03UL51和UL52,分别编码252和1124个氨基酸。DEV Clone-03UL51和UL52基因排列方式与HSV-1同源基因相一致,为"头对头"的转录方向,两个ORF间有236bp间隔序列。用DNAStar(Megalign)软件分别对这2个ORF和11株α-疱疹病毒参考毒株进行分析,发现DEV Clone-03UL51与HSV-1的氨基酸序列有相对较高同源性,DEV Clone-03UL52与EHV-4同源性相对较高。并且DEV Clone-03UL51基因在α-疱疹病毒中比较保守。与HSV-1UL52蛋白相似,DEV Clone-03UL52蛋白C末端存在锌指结构。系统发育分析表明,DEV Clone-03与α疱疹病毒亚科成员的关系比较保守,与Mardivirus属的成员具有较近的亲缘关系。

关键词：鸭肠炎病毒靶基因步行PCR UL51 UL52 序列分析

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