检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2014年第9期30卷 1390-1400页

作者：张家瑚钟晶晶戴剑漉王以光夏焕章赫卫清沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳110016 中国医学科学院/中国协和医科大学医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050

拟研究异源调控系统提高耐热链霉菌Streptomyces thermotolerans 4″-O-异戊酰基转移酶基因（ist）表达的可能性。在麦迪霉素产生菌Streptomyces mycarofaciens 1748中曾克隆到BamHⅠ~8.0 kb片段,含此基因片段的变铅青链霉菌TK24 Strept... 详细信息

拟研究异源调控系统提高耐热链霉菌Streptomyces thermotolerans 4″-O-异戊酰基转移酶基因（ist）表达的可能性。在麦迪霉素产生菌Streptomyces mycarofaciens 1748中曾克隆到BamHⅠ~8.0 kb片段,含此基因片段的变铅青链霉菌TK24 Streptomyces lividans TK24转化子可将螺旋霉素高效转化为丙酰螺旋霉素。序列分析表明此片段除包含麦迪霉素4″-O-丙酰基转移酶基因（mpt）外还存在与其连锁的两个正调控基因orf27和orf28。将这个基因簇中mpt基因的orf替换为ist基因的orf,然后与两个正调控基因或者单独一个orf27连接,将这些构建好的片段分别克隆到中等拷贝数及高拷贝数载体pKC1139和pWHM3上,再转化到*** TK24中。通过测定*** TK24转化子中螺旋霉素生物转化为4″-O-酰化螺旋霉素的产率来评价mpt和ist基因的表达水平。结果表明只有高拷贝载体pWHM3构建的重组质粒*** TK24转化子中才能明显检测到4″-O-异戊酰螺旋霉素的产生。mpt基因的正调节系统可以提高ist基因的表达水平,含两个调节基因的转化子转化效率高于含单一调节基因的转化子。

关键词：螺旋霉素 4″-O-酰基转移酶基因正调控基因异源表达

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异戊酰螺旋霉素生物合成基因簇的鉴定

异戊酰螺旋霉素生物合成基因簇的鉴定

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第二届中国放线菌生物学与产业化研讨会

作者：钟晶晶张家瑚赫卫清中国医学科学院/中国协和医科大学医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京 100050

必特螺旋霉素是4″酰化的螺旋霉素混合物,以4″-O-异戊酰螺旋霉素为主要成分,是将碳霉素产生菌(Streptomyces thermotolerans)中的异戊酰基转移酶基因(4″-O-isovaleryltransferase gene,ist)克隆到螺旋霉素产生菌(Streptomyces spiramyceticus 1941)中,使其产生4″-O-异戊酰螺旋霉素,即必特螺旋霉素,它口服生物利用度好,组织浓度高,具有较长的抗生素后效应,已经完成Ⅲ期临床试验.

关键词：异戊酰螺旋霉素生物合成调控基因

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AHBA合酶基因的筛选与放线菌素D产生菌的发现

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中国抗生素杂志 2009年第1期34卷 30-33页

作者：张会图刘爱明武临专孙桂芝韩锋高群杰张玉琴王以光中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050

根据3,5-AHBA合酶基因序列的保守性所设计的简并引物,通过PCR的方法,从20株未知产物放线菌菌株中,获得两个AHBA合酶基因阳性菌株(*** 4353和Streptomyces rochei 4088)。同源性分析显示,克隆到的3,5-AHBA合酶与已知的3,5-AHBA合酶蛋白... 详细信息

根据3,5-AHBA合酶基因序列的保守性所设计的简并引物,通过PCR的方法,从20株未知产物放线菌菌株中,获得两个AHBA合酶基因阳性菌株(*** 4353和Streptomyces rochei 4088)。同源性分析显示,克隆到的3,5-AHBA合酶与已知的3,5-AHBA合酶蛋白序列有一定的同源性(86%～87%)。对其中一株阳性菌株4353(*** 4353)的发酵活性产物进行了化学分离纯化和TLC、HPLC-UV、MS、~1H-NMR和^(13)C-NMR等分析结构鉴定,表明其发酵产生的一个活性成分为放线菌素D。基因单交换阻断实验结果证明,4353菌株所产生的放线菌素D确实与3,5-AHBA合酶基因相关。本文对获得这一结果的可能原因进行了讨论。

关键词： 3 5-AHBA合酶基因基因阻断放线菌素D

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Streptomyces sp. 4353中3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)合酶基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

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中国抗生素杂志 2009年第1期34卷 24-29页

作者：武临专刘爱明马春燕韩锋张会图高群杰王以光中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050 沈阳药科大学沈阳110016

目的克隆Streptomyces sp.4353中的3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)合酶基因,并将其在大肠埃希菌中表达。方法参与AHBA生物合成的5个基因,即氨基奎尼酸脱水酶基因、氨基奎尼酸/莽草酸脱氢酶基因、AHBA合酶基因、氧化还原酶基因和磷酸酶基因... 详细信息

目的克隆Streptomyces sp.4353中的3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)合酶基因,并将其在大肠埃希菌中表达。方法参与AHBA生物合成的5个基因,即氨基奎尼酸脱水酶基因、氨基奎尼酸/莽草酸脱氢酶基因、AHBA合酶基因、氧化还原酶基因和磷酸酶基因通常连锁,形成一个AHBA生物合成基因簇。本文通过分析、比较已知AHBA生物合成基因簇的基因组织结构特点和序列保守性,设计引物,以Streptomyces sp.4353的总DNA为模板,在已知737bp AHBA合酶基因部分序列的基础上,通过PCR扩增其上、下游DNA序列,克隆至pMDl8-T载体上,测序、拼接并进行生物信息学分析。以pET24a(+)为表达载体,对克隆得到的AHBA合酶基因在大肠埃希菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL中进行表达和SDS-PAGE检测。结果从Streptomyces sp.4353中得到了一段2872bp大小的DNA片段(NCBI GenBank接受号EU734184),其中含有AHBA生物合成基因簇中的AHBA合酶基因、氧化还原酶基因和磷酸酶基因(部分);AHBA合酶基因在大肠埃希菌中得到了成功表达,在SDS-PAGE上可见到清晰的、与预计大小(42.7ku)一致的蛋白表达特异条带。结论Streptomyces sp.4353中的AHBA合酶基因的克隆以及在大肠埃希菌中的表达为进一步研究该基因的功能奠定了基础。本研究克隆得到的2872bp DNA片段还有可能用于AHBA的杂合/异源生物合成,以及安莎类抗生素的组合生物合成。

关键词： AHBA合酶基因克隆与表达链霉菌4353

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具有产生安莎类抗生素潜能的放线菌的分子筛选(英文)

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中国抗生素杂志 2008年第7期33卷 396-402页

作者：武临专张会图韩锋高群杰孙桂芝王以光卫生部抗生素生物工程重点实验室中国医学科学院医药生物技术研究所中国协和医科大学北京100050

目的建立一种高通量筛选具有产生安莎类抗生素潜能的放线菌的分子筛选方法。原理3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)是安莎类抗生素生物合成的前体。在通过氨基莽草酸途径生物合成AHBA的过程中,AHBA合酶是催化5-氨基-3-脱氢-5-脱氧莽草酸形成A... 详细信息

目的建立一种高通量筛选具有产生安莎类抗生素潜能的放线菌的分子筛选方法。原理3-氨基-5-羟基-苯甲酸(AHBA)是安莎类抗生素生物合成的前体。在通过氨基莽草酸途径生物合成AHBA的过程中,AHBA合酶是催化5-氨基-3-脱氢-5-脱氧莽草酸形成AHBA的一个特异性关键酶。AHBA合酶基因的存在可以作为放线菌菌株具有合成安莎类抗生素能力的一个必要而非充分的条件。AHBA合酶基因高度保守,通过PCR方法可以建立一种针对AHBA合酶基因存在与否的、具有安莎类抗生素产生潜能的放线菌菌株高通量筛选方法。方法根据已知AHBA合酶序列的相似性,设计了针对AHBA合酶基因中高度保守的一段755bp片段大小的PCR筛选寡核苷酸引物,用于从土壤中分离的未知放线菌高通量筛选。结论从1900株土壤分离的未知放线菌中筛选获得33株AHBA合酶基因阳性菌株,即具有安莎类抗生素产生潜能的放线菌菌株。

关键词：安莎霉素类 AHBA合酶基因聚合酶链反应分子筛选放线菌

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格尔德霉素生物合成的调控基因

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生物工程学报 2008年第5期24卷 717-722页

作者：赫卫清雷健刘玉瑛王以光中国医学科学院/中国协和医科大学医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050

从吸水链霉菌17997中克隆了格尔德霉素(Geldanamycin,Gdm)生物合成酶基因簇,通过生物信息学分析发现两个LAL(Large ATP-bindingregulators of the LuxR family)家族的调控基因gdmRI和gdmRII,基因阻断和基因回复实验证实这两个基因产物... 详细信息

从吸水链霉菌17997中克隆了格尔德霉素(Geldanamycin,Gdm)生物合成酶基因簇,通过生物信息学分析发现两个LAL(Large ATP-bindingregulators of the LuxR family)家族的调控基因gdmRI和gdmRII,基因阻断和基因回复实验证实这两个基因产物都正调控Gdm的生物合成。

关键词：格尔德霉素(Geldanamycin,Gdm) 调控基因基因阻断

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KDR酪氨酸激酶的克隆表达及纯化

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生物工程学报 2008年第9期24卷 1545-1549页

作者：刘春平张洋李元中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050

VEGF作为一种血管内皮细胞有丝分裂原,通过与内皮细胞表面特定受体结合,从而导致新生血管的形成,其中VEGFR-2(KDR/Flk-1)在肿瘤血管形成中起重要作用,因此其抑制剂有可能发展成为治疗肿瘤的新药。采用大肠杆菌成功表达了具有酪氨酸激酶... 详细信息

VEGF作为一种血管内皮细胞有丝分裂原,通过与内皮细胞表面特定受体结合,从而导致新生血管的形成,其中VEGFR-2(KDR/Flk-1)在肿瘤血管形成中起重要作用,因此其抑制剂有可能发展成为治疗肿瘤的新药。采用大肠杆菌成功表达了具有酪氨酸激酶活性的KDR酪氨酸激酶催化域(KDR-CD)。采用RT-PCR从人脐静脉内皮细胞中提取总RNA,获得KDR-CD的编码基因,将其克隆至pET-30a载体,在*** BL21(DE3)中进行了成功表达,采用Ni-NTA亲和层析对其进行了纯化,Western blotting结果显示表达的KDR-CD蛋白自身磷酸化,重组KDR-CD蛋白具有利用ATP催化底物发生磷酸化反应的激酶活性。

关键词：血管生成 KDR酪氨酸激酶大肠杆菌酪氨酸激酶活性

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格尔德霉素基因工程高产菌株的构建和培养

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生物工程学报 2008年第1期24卷 15-20页

作者：赫卫清周红霞王红远高群杰王以光中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid,AHBA)的生物合成基因簇,根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因... 详细信息

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid,AHBA)的生物合成基因簇,根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin,Gdm)起始单位的合成,而萘醌类的AHBA基因簇可能参与未知安莎化合物的生物合成。为提高吸水链霉菌17997菌种的Gdm发酵产量,并研究高产菌种在固体培养基上孢子的生长周期。采用基因阻断技术,将吸水链霉菌17997中的萘醌类AHBA生物合成基因簇(shnSOP)进行破坏,以获得ΔSOP菌株,从而减少对合成所需共同底物AHBA的争夺。HPLC分析结果表明ΔSOP菌株Gdm的发酵产量比原株提高185%。同时,通过孢子计数发现该菌株在固体培养基上的孢子生长经历2个周期,第2代孢子菌种的Gdm产量较高。

关键词：吸水链霉菌17997 格尔德霉素基因阻断孢子形成周期

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表皮生长因子受体酪氨酸激酶的克隆表达和酶抑制剂筛选模型的构建

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中国生物工程杂志 2008年第10期28卷 12-17页

作者：张洋刘春平李元中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)属受体酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)家族,其胞内的酪氨酸激酶在细胞信号转导通路中具有十分重要的作用。许多肿瘤的发生、发展都与EGFR胞内酪氨酸激酶的异常表达密切相关。... 详细信息

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)属受体酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)家族,其胞内的酪氨酸激酶在细胞信号转导通路中具有十分重要的作用。许多肿瘤的发生、发展都与EGFR胞内酪氨酸激酶的异常表达密切相关。因此,EGFR胞内酪氨酸激酶的抑制剂有可能成为治疗肿瘤的有效药物。从人脐静脉内皮细胞(HUVEC)提取总RNA,采用RT-PCR获得EGFR酪氨酸激酶催化域的编码基因。将其克隆至载体pET-30a,在***21(DE3)中进行了成功表达,采用Ni-NTA亲和层析对其进行了纯化。通过对酶的活性的测定,证明重组EGFR酪氨酸激酶蛋白具有利用ATP催化底物发生磷酸化反应的激酶活性。以该重组激酶为靶位构建了酶抑制剂筛选模型,拟对微生物代谢产物进行筛选。

关键词： EGFR酪氨酸激酶克隆表达重组蛋白抑制剂筛选模型

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格尔德霉素生物合成基因功能的验证

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生物工程学报 2008年第7期24卷 1133-1139页

作者：赫卫清刘玉瑛孙桂芝王以光中国医学科学院/中国协和医科大学医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050

格尔德霉素(Geldanamycin,Gdm)作为热休克蛋白90的特异性抑制剂,是非常有前景的抗肿瘤和抗病毒的药物,我们已从吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus17997)的基因文库中获得了Gdm大部分生物合成基因。为了研究主要基因的功能,选... 详细信息

格尔德霉素(Geldanamycin,Gdm)作为热休克蛋白90的特异性抑制剂,是非常有前景的抗肿瘤和抗病毒的药物,我们已从吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus17997)的基因文库中获得了Gdm大部分生物合成基因。为了研究主要基因的功能,选择了聚酮合酶基因(Polyketide synthase gene,pks)的第六模块、单加氧酶基因(Mono-oxygenase gene,gdmM)和氨甲酰基转移酶基因(Carbamoyltransferase gene,gdmN)3个基因作为靶点分别进行基因阻断,获得了基因同源双交换的阻断变株△pks、△gdmM和△gdmN。经HPLC检测证实这些基因的阻断变株均不产生Gdm,基因回复实验排除了基因阻断所可能造成的极性效应对其它基因表达的影响,说明所克隆的pks、gdmM和gdmN基因确实是Gdm生物合成所必需的基因。

关键词：吸水链霉菌17997 格尔德霉素(Gdm) 基因阻断基因回复

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