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烟曲霉对人急性单核细胞白血病细胞系产生肿瘤坏死因子α、活化信号分子p38丝裂原活化蛋白激酶的影响

中华皮肤科杂志 2018年第9期51卷 653-657页

作者：童建波杜蕾蕾曾荣王丽玮刘宇甄段志敏陈青李岷中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所江苏省皮肤性病分子生物学重点实验室南京210042 江苏省血液中心南京210042

目的探讨烟曲霉对人急性单核细胞白血病细胞系THP-1细胞分泌肿瘤坏死因子仪（TNF-α）和细胞内信号分子β38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活的影响。方法10^6、10^7CFU／ml烟曲霉悬液（10^6和10^7CFU／ml烟曲霉组）、100mg／L阳性刺激物... 详细信息

目的探讨烟曲霉对人急性单核细胞白血病细胞系THP-1细胞分泌肿瘤坏死因子仪（TNF-α）和细胞内信号分子β38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活的影响。方法10^6、10^7CFU／ml烟曲霉悬液（10^6和10^7CFU／ml烟曲霉组）、100mg／L阳性刺激物β-葡聚糖（β-葡聚糖组）及培养基（空白对照组）分别与2×10^5／mlTHP-1细胞共孵育1、3、6h，实时荧光定量PCR分析各组THP-1细胞TNF-α mRNA表达水平。10^7CFU／ml烟曲霉悬液（烟曲霉组）、β-葡聚糖（β-葡聚糖组）及培养基分别作用THP-1细胞24h，酶联免疫吸附法检测各组培养上清液中TNF-α含量。Western印迹法检测10^7CFU／ml烟曲霉体外作用THP-1细胞后15、30、60minβ38MAPK和磷酸化β38MAPK水平。采用20μmol／LSB203580预先与THP-1细胞共培养2h后，再用10^7CFU／ml烟曲霉、β-葡聚糖或培养基作用6h，检测各组THP-1细胞TNF-α mRNA表达水平变化。结果10^6、10^7CFU／ml烟曲霉组、100mg／L β-葡聚糖组及空白对照组TNF-α mRNA表达水平差异有统计学意义（F=110．983，P〈0．001），且随培养时间延长，THP-1细胞TNF-α mRNA水平增高（F=701．680，P〈0．001）。1^7CFU／ml烟曲霉刺激THP-1细胞24h后，TNF-α蛋白水平（6236．30±437．12ng／L）较空白对照组（132．10±0．61ng／L）明显升高（P〈0．01）。10^7CFU／ml烟曲霉作用THP-1细胞30min后磷酸化β38MAPK蛋白水平明显升高，60rain时开始减弱。SB203580阻断的烟曲霉组TNF-α mRNA表达水平（3．83±0．62）较未阻断的烟曲霉组（187．23±21．62）明显降低。结论人THP-1细胞体外与烟曲霉作用后激活信号分子β38MAPK并分泌TNF-α，表明单核细胞可能参与抗烟曲霉感染固有免疫反应。

关键词：烟曲霉菌肿瘤坏死因子α p38丝裂原活化蛋白激酶类 THP-1细胞

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抗念珠菌天然产物的研究进展

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中国真菌学杂志 2023年第2期18卷 183-187页

作者：余宇佘晓东刘维达中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所南京210042 江苏省皮肤病与性病学分子生物学重点实验室南京210042

念珠菌是常见的致病真菌,已在世界范围内引起大量的人类真菌病。据报道念珠菌是医院获得性血液感染的第四大原因[1-2],白念珠菌感染是人类最常见的侵袭性念珠菌病,占50%以上[3]。发生侵袭性念珠菌感染常与糖皮质激素的大量使用、广谱抗... 详细信息

念珠菌是常见的致病真菌,已在世界范围内引起大量的人类真菌病。据报道念珠菌是医院获得性血液感染的第四大原因[1-2],白念珠菌感染是人类最常见的侵袭性念珠菌病,占50%以上[3]。发生侵袭性念珠菌感染常与糖皮质激素的大量使用、广谱抗生素的长期使用以及免疫功能受损相关。目前使用的抗真菌药物种类有限,主要包括唑类、多烯类和棘白菌素类。

关键词：天然产物抗念珠菌研究进展

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外周血单一核细胞的体外活化对成纤维细胞增殖和基质金属蛋白酶产生的影响

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中华皮肤科杂志 2015年第11期48卷 801-806页

作者：康玉英孙彩虹鞠梅陈崑顾恒山西医学科学院山西大医院皮肤性病科太原030032 江苏大学附属人民医院皮肤科中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所江苏省皮肤病号胜病分子生物学重点实验室

目的研究不同活化剂对外周血单一核细胞（PBMC）产生基质金属蛋白酶（MMP）的影响以及PBMC活化后培养上清液［称为条件培养基（CM）］对培养的皮肤成纤维细胞增殖活性、产生MMP的影响。方法抽取、分离健康人PBMC，分为植物血凝素（PH... 详细信息

目的研究不同活化剂对外周血单一核细胞（PBMC）产生基质金属蛋白酶（MMP）的影响以及PBMC活化后培养上清液［称为条件培养基（CM）］对培养的皮肤成纤维细胞增殖活性、产生MMP的影响。方法抽取、分离健康人PBMC，分为植物血凝素（PHA）组、双抗体组、对照组，分别用活化剂PHA、CD3和CD28双抗体、含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基处理细胞，72 h后收集三组CM，并将获得的CM按不同比例稀释后作用于培养的成纤维细胞，以不加CM作为对照组，培养48或24 h。采用噻唑蓝法检测细胞增殖能力，半定量反转录（RT）-PCR法检测细胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA表达水平，酶联免疫吸附实验（ELISA）检测上清液中白介素（IL）-6、MMP-1、MMP-3、MMP-9蛋白含量。采用单因素方差分析、Tukey HSD检验、Games-Howell检验等方法进行统计学分析。结果与对照组相比，PHA组PBMC增殖活性及分泌IL-6、MMP-3水平明显增加，差异均有统计学意义（P 〈 0.05）；3组活化后上清液中均未检测到MMP-1、MMP-9蛋白。对照组、双抗体组、PHA组PBMC中MMP-1 mRNA相对表达水平（以靶基因与β肌动蛋白mRNA之比表示）0.083 ± 0.016、0.188 ± 0.030、0.714 ± 0.104，差异有统计学意义（P 〈 0.05），MMP-3、MMP-9 mRNA均无表达。不同稀释度CM刺激成纤维细胞后上清液中可检测到MMP-3蛋白，MMP-3含量以原液CM中最高，1/10 CM刺激时最低；在相同的稀释度刺激时，上清液中MMP-3含量以PHA刺激组最高，对照刺激组最低；不同CM刺激成纤维细胞后上清液中均未检测到MMP-1、MMP-9蛋白。不同处理组成纤维细胞的增殖能力及MMP-1、MMP-3 mRNA表达差异均无统计学意义（P 〉 0.05），MMP-9 mRNA无表达。结论 PBMC活化后可表达MMP-1 mRNA并分泌MMP-3蛋白，PBMC活化后上清液不能刺激成纤维细胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA及蛋白表达，提示炎症细胞可能通过自身产生MMP而发挥作用。

关键词：白细胞单核成纤维细胞基质金属蛋白酶类细胞增殖植物血凝素类

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暗色真菌感染病原学诊断方法和治疗药物研究进展

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中国真菌学杂志 2021年第1期16卷 69-72页

作者：景丹蕤李筱芳刘维达中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所南京210042 江苏省皮肤病与性病学分子生物学重点实验室南京210042

暗色真菌是一组孢子和/或菌丝的壁具有黑色素样颜色的真菌,是一种广泛存在于自然界的腐生寄生生物,包括大约70个属和150个种[1]。暗色真菌可引起皮肤组织和内部脏器深部真菌感染,导致着色芽生菌病、暗色丝孢霉病和足菌肿等。此类感染致... 详细信息

暗色真菌是一组孢子和/或菌丝的壁具有黑色素样颜色的真菌,是一种广泛存在于自然界的腐生寄生生物,包括大约70个属和150个种[1]。暗色真菌可引起皮肤组织和内部脏器深部真菌感染,导致着色芽生菌病、暗色丝孢霉病和足菌肿等。此类感染致病菌种类繁多,临床表现缺乏特异性,诊断和治疗较为困难。病原菌准确和快速的鉴定有助于早期明确诊断,新的抗真菌药物的研发可帮助临床工作者对暗色真菌的感染更加合理地选择治疗药物。本文将围绕暗色真菌感染病原学诊断方法和治疗药物研究的进展作一综述。

关键词：暗色真菌病原学诊断治疗药物研究进展

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Gateway技术构建人RhoD慢病毒表达载体及转染人黑素瘤A375细胞株

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中国皮肤性病学杂志 2016年第10期30卷 998-1002页

作者：温斯健倪娜娜周晓伟吴琼王小坡宋昊张韡孙建方中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所病理科江苏南京210042 中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所江苏省皮肤病性病分子生物学重点实验室江苏南京210042

目的构建人RhoD基因的慢病毒载体并进行慢病毒包装和鉴定，转染人黑素瘤细胞A375，使其过表达RhoD蛋白，为后续研究RhoD在黑素瘤中的作用奠定基础。方法Gateway技术构建携带增强型绿色荧光蛋白EGFP的RhoD慢病毒载体，经PCR及基因测序鉴... 详细信息

目的构建人RhoD基因的慢病毒载体并进行慢病毒包装和鉴定，转染人黑素瘤细胞A375，使其过表达RhoD蛋白，为后续研究RhoD在黑素瘤中的作用奠定基础。方法Gateway技术构建携带增强型绿色荧光蛋白EGFP的RhoD慢病毒载体，经PCR及基因测序鉴定后，与辅助质粒pLV／helper-SL3，pLV／helper—SIA及pLV／helper—SL5混合采用脂质体法制备DNA-Lipofectamine2000复合物，并共同转染293FT细胞进行慢病毒包装，产生相应慢病毒颗粒，通过定量PCR方法测定病毒滴度。包装好的慢病毒转染人黑素瘤A375细胞，荧光显微镜下观察荧光表达情况，流式细胞仪检测转染效率；实验分为A375（未处理对照组）、A375-EGFP（不含目的基因的空病毒对照组）和A375-RhoD（含RhoD基因的病毒组）三组，采用实时荧光定量PCR（QPCR）及免疫印记法（western blotting，WB）验证耽扣在A375-RhoD组细胞中的过表达。结果通过PCR、基因测序证实，慢病毒表达载体pLV[Exp]-EGFP／Neo—CMV〉hRhoD构建成功。与辅助质粒共转染293FT细胞包装出具高效感染力的慢病毒，经测定病毒滴度为（5．13±2）×10^8TU／mL。转染A375细胞后可见明显的绿色荧光表达，流式检测转染效率大于80％;A375-RhoD组RhoDmRNA及蛋白水平均较A375-EGFP组和A375组细胞中明显增高。结论成功构建RhoD慢病毒表达载体，包装出具高效感染力的慢病毒颗粒并成功转染人黑素瘤A375细胞，为进一步研究RhoD在黑素瘤中的作用提供实验基础。

关键词： RhoD基因慢病毒载体 Gateway技术过表达 A375

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Nicastrin基因突变的反常性痤疮患者皮损Notch—HES信号通路的表达

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中华皮肤科杂志 2016年第6期49卷 415-419页

作者：李诚让何艳艳张晓峰徐浩翔王宝玺福建医科大学附属协和医院皮肤科福州350001 中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室皮肤科中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院皮肤科

目的检测nicastrin基因突变的反常性痤疮患者皮损标本中，nicastrin及其下游Notch—HES信号通路蛋白的表达。方法免疫组化法检测nicastrin及Notch—HES信号通路分子在4例nicastrin基因突变的患者皮损石蜡标本的表达，并用6例正常皮肤组... 详细信息

目的检测nicastrin基因突变的反常性痤疮患者皮损标本中，nicastrin及其下游Notch—HES信号通路蛋白的表达。方法免疫组化法检测nicastrin及Notch—HES信号通路分子在4例nicastrin基因突变的患者皮损石蜡标本的表达，并用6例正常皮肤组织作对照，同时采用Spearman相关分析，分析nicastrin与Notch—HES信号通路分子表达的相关性。结果Nicastrin蛋白广泛表达于表皮全层、皮肤附属器，如，毛囊皮脂腺单位、大汗腺及小汗腺。在携带nicastrin基因突变的患者皮损中，表皮及毛囊漏斗部nicastrin表达较正常对照明显减少；同时，Notch—HES信号通路分子表达亦较正常对照明显减少。Nicastrin蛋白与Notchl、Notch3以及HES一1的表达呈明显正相关（r分别为0．831、0．748、0．807，P值分别〈0．01，〈0．05、〈0．01），而与Notch2、HES一5的表达之间的相关性，差异无统计学意义（r分别为0．597和0．591，均P〉0．05）。结论Nicastrin基因突变患者的皮损中nicastrin低表达，且与多种Notch—HES信号通路分子表达呈正相关，提示nicastrin表达减少可能通过影响下游Notch—HES信号通路的表达参与反常性痤疮的发病。

关键词：基因突变信号传导反常性痤疮 Nicastrin基因 Notch—HES信号通路

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中国大陆地区暗色丝孢霉病(1987～2017年)回顾性分析

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中国真菌学杂志 2018年第5期13卷 272-276页

作者：贺赟郑海林李筱芳吕桂霞沈永年刘维达北京协和医学院中国医学科学院皮肤病研究所南京210042 江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室南京210042 宜兴市皮肤病医院皮肤科宜兴214200

目的了解中国大陆地区近30年暗色丝孢霉病的流行病学和诊治状况。方法通过CNKI、万方、维普、Embase和Pubmed检索1987～2017年中国大陆地区暗色丝孢霉病相关文献,进行数据分析和总结。结果共纳入文献106篇,共计有115例患者。感染类型以... 详细信息

目的了解中国大陆地区近30年暗色丝孢霉病的流行病学和诊治状况。方法通过CNKI、万方、维普、Embase和Pubmed检索1987～2017年中国大陆地区暗色丝孢霉病相关文献,进行数据分析和总结。结果共纳入文献106篇,共计有115例患者。感染类型以皮肤及皮下组织型为主,继发于皮肤屏障被破坏、特发性免疫功能异常最多。诊断主要依据真菌镜检、组织病理、真菌培养和分子鉴定。治疗以系统抗真菌药物为主,伊曲康唑为首选用药。107例患者中因该病死亡10例,占9.35%;其中以中枢神经系统型死亡率最高,达75%。结论中国大陆地区暗色丝孢霉病感染数有明显上升趋势。临床医生应提高该病各型临床及病原诊断水平,并积极开展分子鉴定和体外药物敏感性试验,为临床治疗提供更为有效的依据。

关键词：暗色丝孢霉病诊断治疗

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烟曲霉钙调蛋白的红色荧光蛋白标记及其在菌株极性生长的动态分布

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中华皮肤科杂志 2018年第1期51卷 43-47页

作者：曾荣童建波刘宇甄陈青段志敏刘彩霞吕桂霞林彤李岷中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所激光科江苏省皮肤性病学分子生物学重点实验室南京210042 中国医学科学院北京协和医学院真菌科南京210042 江苏省血液中心

目的构建自身启动子调控、含有红色荧光蛋白（RFP）标记的钙调蛋白烟曲霉菌株，观察菌株生长过程中钙调蛋白的动态分布。方法设计烟曲霉钙调蛋白基因的两端侧翼序列，对两序列及含有RFP-烟曲霉pyrG 营养标记（mRFP-AfpyrG）的质粒分... 详细信息

目的构建自身启动子调控、含有红色荧光蛋白（RFP）标记的钙调蛋白烟曲霉菌株，观察菌株生长过程中钙调蛋白的动态分布。方法设计烟曲霉钙调蛋白基因的两端侧翼序列，对两序列及含有RFP-烟曲霉pyrG 营养标记（mRFP-AfpyrG）的质粒分别进行PCR扩增，再通过融合PCR对上述3个片段进行整合，形成转化用的线性片段。随后采用原生质体转化法将上述片段转入烟曲霉受体菌株中，构建钙调蛋白-RFP烟曲霉菌株。在营养筛选培养基平板上挑取单克隆菌落培养，选取荧光表型最稳定的单菌菌落对其转化子进行PCR验证。将重组菌株和野生菌株分别接种于固体营养培养基中，培养不同时间后荧光显微镜下观察菌株形态学差异。将上述两株菌分别接种于液体培养基中，甲基四氮盐（XTT）方法观察其生长活力差异，并对红色荧光标记菌株进行动态活体观察，分析钙调蛋白在烟曲霉生长发育过程中的时空分布。结果重组菌株的荧光表型及转化子的PCR鉴定结果表明，钙调蛋白-RFP烟曲霉菌株构建成功。重组菌株与野生菌株在24 h时生长活力（A490值）分别为0.689 ± 0.081和0.678 ± 0.054（t = 1.32，P〉0.05），差异无统计学意义，且形态学方面也无显著差异。钙调蛋白在烟曲霉生长过程中始终处于极性生长过程中的菌丝顶端、分枝出芽点及新形成的分枝顶端。结论钙调蛋白可能参与调控烟曲霉孢子萌发及菌丝极性生长等重要生物学过程。

关键词：烟曲霉菌钙调蛋白菌丝荧光蛋白质示踪红色荧光蛋白

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白念珠菌药物耐受机制研究进展

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中国真菌学杂志 2023年第6期18卷 546-549页

作者：黄宇颖刘维达李筱芳中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所真菌科南京210042 江苏省皮肤病与性病学分子生物学重点实验室南京210042

白念珠菌是侵袭性念珠菌病最常见的致病菌,念珠菌血症的高死亡率和不良预后造成了严重的临床问题。由于治疗药物有限,其耐药问题使临床治疗面临严峻挑战。此外,对于一部分持续性感染的患者,即使采用体外药敏试验提示敏感的药物进行治疗... 详细信息

白念珠菌是侵袭性念珠菌病最常见的致病菌,念珠菌血症的高死亡率和不良预后造成了严重的临床问题。由于治疗药物有限,其耐药问题使临床治疗面临严峻挑战。此外,对于一部分持续性感染的患者,即使采用体外药敏试验提示敏感的药物进行治疗,也常常伴随迁延不愈和复发,临床疗效和低耐药率不一致的情况可能和药物耐受有关。而临床上常将耐受和耐药概念混淆,忽视白念珠菌耐受对治疗的影响。该文就白念珠菌耐受的概念、机制及其与耐药之间的联系进行综述。

关键词：白念珠菌耐受耐药抗真菌药

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EGFR通路在相关皮肤病发病机制中的研究进展

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中国麻风皮肤病杂志 2020年第11期36卷 697-700页

作者：王雯竹何艳艳徐浩翔中国医学科学院&北京协和医学院皮肤病医院(研究所) 南京210042 江苏省皮肤性病学分子生物学重点实验室南京210042

表皮生长因子受体(EGFR)是一种受体酪氨酸激酶,存在于几乎所有上皮细胞和多种间充质细胞的细胞膜上,EGFR通路的失调可能导致细胞增殖、血管生成、细胞凋亡受损、细胞侵袭性增强,影响银屑病、特应性皮炎等炎症性皮肤病和皮肤鳞状细胞癌... 详细信息

表皮生长因子受体(EGFR)是一种受体酪氨酸激酶,存在于几乎所有上皮细胞和多种间充质细胞的细胞膜上,EGFR通路的失调可能导致细胞增殖、血管生成、细胞凋亡受损、细胞侵袭性增强,影响银屑病、特应性皮炎等炎症性皮肤病和皮肤鳞状细胞癌、黑素瘤等肿瘤性皮肤病的发生与发展,本文综述了EGFR通路在相关皮肤病发病机制中的研究进展。

关键词：表皮生长因子受体丝裂原活化蛋白激酶磷脂酰肌醇3-激酶

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