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中国比较医学杂志 2025年第1期35卷 30-40页

作者：侯婧涵段素琴徐鸿界孙文亭李明学李艳艳靳玮华陈丽雄刘权赵远杨凤梅和占龙中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 呼吸与共病全国重点实验室北京100005

目的建立柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CVA6)和B组1型(coxsackievirus B1,CVB1)混合感染叙利亚金黄地鼠手足口病动物模型。方法本研究将24只地鼠分为CVA6感染组、CVB1感染组、CVA6和CVB1混合感染组及对照组,采取鼻腔滴注病毒液和... 详细信息

目的建立柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CVA6)和B组1型(coxsackievirus B1,CVB1)混合感染叙利亚金黄地鼠手足口病动物模型。方法本研究将24只地鼠分为CVA6感染组、CVB1感染组、CVA6和CVB1混合感染组及对照组,采取鼻腔滴注病毒液和PBS方式造模。监测记录15 d内临床指标、生理指标、排毒情况,并在感染后第7天(D7)选取动物进行组织病理学和病毒抗原与核酸检测。结果单独和混合感染的实验组地鼠均出现类似人类手足口病的临床症状;WBC、NEUT、LYMPH结果提示病毒感染血象特征;咽拭子、粪便、血液和组织中均能检测到两种病毒核酸;粪便样品中能分离出两种病毒;脑等组织出现病理损伤表现及CVA6和CVB1病毒抗原蛋白和核酸的阳性共定位。结论经鼻腔同时滴注CVA6和CVB1混合液能够成功感染叙利亚金黄地鼠,复制出类似人类手足口病的疱疹、造成病毒性心肌炎和脑炎病理损伤等,结果显示混合感染组相较于单独感染组病情更为严重,表现为临床症状加重、病毒复制增高以及组织病理损伤明显。本研究为开展人类肠道病毒混合感染基础和临床研究提供一定借鉴和参考。

关键词：叙利亚金黄地鼠混合感染动物模型柯萨奇病毒A组6型柯萨奇病毒B组1型手足口病

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野生恒河猴肠道病毒病原谱分析

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实验动物科学 2025年第1期42卷 12-17页

作者：侯婧涵徐鸿界孙文亭李明学李艳艳靳玮华杨凤梅和占龙中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 呼吸与共病全国重点实验室北京100005

目的本研究旨在调查野生恒河猴的肠道病毒病原谱状况,为野生猴群疾病预防、引入及饲养管理人员职业健康防护提供科学依据。方法本研究收集云南省218份野生恒河猴新鲜粪便样本,提取病毒RNA,采用肠道病毒通用引物222/224、AN88/AN89进行巢... 详细信息

目的本研究旨在调查野生恒河猴的肠道病毒病原谱状况,为野生猴群疾病预防、引入及饲养管理人员职业健康防护提供科学依据。方法本研究收集云南省218份野生恒河猴新鲜粪便样本,提取病毒RNA,采用肠道病毒通用引物222/224、AN88/AN89进行巢式PCR检测,对阳性样本进行测序分析,以确认病毒种类。结果恒河猴肠道病毒携带率为11%(24/218),其中,婴猴组携带率为7.5%(4/53);青少年猴组携带率为3.5%(2/57);成年猴组携带率为16.7%(9/54);老年猴组携带率为16.7%(9/54)。结论经肠道病毒基因分型确定该肠道病毒病原谱主要为肠道病毒J组、肠道病毒sp.组和肠道病毒A组;经系统发育分析发现218只野生恒河猴肠道病毒病原谱与EVJ、EVA92、EVA119、SV19和SV46等亲缘关系较近。

关键词：肠道病毒野生恒河猴年龄性别系统发育

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柯萨奇病毒B组4型TaqMan探针一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证

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中国生物制品学杂志 2025年第2期38卷 167-171页

作者：郭伟陈俊薇刘煜菡张名冯昌增马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 云南大学生命科学学院云南昆明650500

目的建立柯萨奇病毒B组4型(Ccoxsackievirus B4,CVB4)Taq Man探针一步法实时荧光定量PCR(real-time fluo-rescence quantitative PCR,RT-q PCR)检测方法,并进行验证,以期为CVB4的快速定量检测提供可靠方法。方法选择CVB4的VP1序列中较保守部分,设计引物和探针;经体外转录获得阳性RNA标准品,绘制标准曲线,建立CVB4的Taq Man探针一步法RT-q PCR法。验证方法的灵敏度、线性范围、重复性、特异性。应用建立的方法检测16份临床样本。结果方法的检测灵敏度为10~3copies/μL;阳性RNA标准品在10^(3)~10^(10)copies/μL范围内,与荧光单位(relative fluorescence unit,RFU)具有良好的线性关系,线性方程为:y=-3.742 x+48.651,R^(2)为0.998;重复性验证CV<2%;与柯萨奇病毒B组其他血清型CVB2、CVB3、CVB5、CVB6,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71),柯萨奇病毒A组(Coxsackie virus A,CVA)8、10、12型(CVA8、CVA10、CVA12),埃可病毒11型(Echovirus 11,E11)均无交叉反应。16份临床样本中12份为CVB4阳性。结论建立的Taq Man探针一步法RT-q PCR检测方法具有较好的灵敏度、特异性和重复性,可用于CVB4临床样品的检测。

关键词：柯萨奇病毒B组4型 TaqMan探针实时荧光定量PCR

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云南省6株柯萨奇A组16型病毒的全基因组分析

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热带医学杂志 2025年第3期 337-342+437页

作者：楚昭阳陈俊薇冯昌增刘煜菡张名李丽马绍辉中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南大学生命科学学院昆明市妇幼保健院检验科

目的分析2022年云南省6株柯萨奇A组16型病毒（CVA16）分离株的全基因组特征，为CVA16的分子流行病学研究及相关疾病的防控提供参考数据。方法 2022年从昆明市妇幼保健院的200份手足口病患儿临床粪便样品中共分离到22株CVA16毒株，将22... 详细信息

目的分析2022年云南省6株柯萨奇A组16型病毒（CVA16）分离株的全基因组特征，为CVA16的分子流行病学研究及相关疾病的防控提供参考数据。方法 2022年从昆明市妇幼保健院的200份手足口病患儿临床粪便样品中共分离到22株CVA16毒株，将22株CVA16的病毒蛋白1(VP1)区域进行扩增及测序，发现该22株CVA16的VP1基因的同源性很高，均达到95%以上，随机选择6株进行全基因组扩增和测序。通过MEGA7.0、DNAStar7.1和SimPlot3.5.1等软件对全基因组序列进行分析。结果 6株分离株分别命名为167/YN/CHN/2022、174/YN/CHN/2022、183/YN/CHN/2022、217/YN/CHN/2022、218/YN/CHN/2022和231/YN/CHN/2022，经对扩增的部分VP1进行鉴定，均为CVA16。6条CVA16基因序列已上传至GenBank数据库，基因登录号为PP532683-PP532688。6株CVA16分离株的全基因组长为7 358～7 405 nt,5’UTR区均为741 nt,3’UTR区长为35～82 nt,5’UTR区和3’UTR区之间是一个长为6 582 nt的开放阅读框，与其他CVA16相比未见核苷酸插入与缺失，编码区编码一个含有2 194个氨基酸残基的多聚蛋白。根据VP1系统进化分析，6株CVA16分离株均位于B1a进化分支。该6株分离株之间的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为94.8%～98.6%和97.9%～99.3%，与中国大陆其他流行株的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为86.5%～97.8%和97.5%～99.5%。与其原型株相比，6株毒株共发生44处氨基酸变异，且在BC环和EF环发生氨基酸置换。重组分析显示，该6株CVA16分离株重组信号较弱，可能未发生新的重组。结论从2022年云南省手足口病患儿临床样本中分离到的6株CVA16均属于B1基因亚型的B1a分支。

关键词：柯萨奇A组16型病毒全基因组序列分析

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4种人脐带间充质干细胞来源外泌体提取方法的比较

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中国生物制品学杂志 2025年第1期38卷 89-95页

作者：赵永美孟明耀李金美宋泽鑫周艳杨武李鸿钧中国医学科学院、北京协和医学院医学生物学研究所、云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 昆明医科大学云南昆明650500 昆明医科大学附属延安医院云南省肿瘤免疫防治重点实验室云南昆明650051

目的比较4种人脐带间充质干细胞来源外泌体(exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs-Exos)的提取方法,以期获得简便、高效、经济的外泌体提取方法。方法传代培养人脐带间充质干细胞(human umbilica... 详细信息

目的比较4种人脐带间充质干细胞来源外泌体(exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs-Exos)的提取方法,以期获得简便、高效、经济的外泌体提取方法。方法传代培养人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSCs),镜下观察细胞形态,并检测细胞增殖能力、特异性表面抗原表达水平及多向分化潜能。分别采用超速离心法、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀法、蔗糖沉淀法和Total Exosome Isolation试剂盒法(简称试剂盒法)4种方法提取HUC-MSCs培养上清液中的hucMSCs-Exos,透射电子显微镜观察外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)技术检测外泌体浓度及颗粒大小,BCA法检测外泌体总蛋白浓度,Western blot法检测外泌体特异性标志蛋白水平。结果传代培养的HUC-MSCs于镜下观察呈长梭形,漩涡贴壁生长,且细胞增殖速度较快;高表达MSCs特异性表面抗原CD73和CD90,极低表达造血干细胞表面标记物CD34和CD45;具有向脂肪及成骨分化的潜能。4种方法均可提取获得HUCMSCs-Exos,除试剂盒法外,其他3种方法提取的外泌体均呈茶托样双层膜结构且边界清晰;试剂盒法提取外泌体的总蛋白浓度及颗粒浓度均明显高于其他3种方法(F=35.18,P均<0.01);4种方法提取的外泌体均能表达特异性标志物CD63和CD81,除蔗糖沉淀法提取外泌体不表达CD9外,其他方法提取的外泌体均表达CD9。结论4种方法均能提取获得外泌体,其中超速离心法提取外泌体质量稳定;试剂盒法提取外泌体的产量较高,且更省时、更便捷;PEG沉淀法及蔗糖沉淀法提取外泌体的纯度更高。可根据不同的生产需求,选择合适的外泌体分离技术。

关键词：外泌体提取人脐带间充质干细胞

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HSV-1衣被蛋白UL7基因的克隆及其在病毒增殖中的表达分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2016年第4期36卷 241-246页

作者：周洁楠徐兴丽高有张莹王晶晶刘龙丁李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的：原核表达并纯化单纯疱疹病毒1型（HSV-1）UL7蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,初步分析UL7蛋白在HSV-1增殖过程中的表达特点。方法 PCR方法扩增UL7基因,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-UL7,转化到E. coli BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,... 详细信息

目的：原核表达并纯化单纯疱疹病毒1型（HSV-1）UL7蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,初步分析UL7蛋白在HSV-1增殖过程中的表达特点。方法 PCR方法扩增UL7基因,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-UL7,转化到E. coli BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,获得并纯化GST-UL7重组蛋白,将其作为抗原免疫ICR小鼠制备抗UL7多克隆抗体。间接法ELISA检测抗体效价,Western blot检测抗体的特异性,使用该多克隆抗体对HSV-1病毒感染Vero细胞后不同时间点的UL7蛋白表达量进行检测。结果 GST-UL7重组蛋白在E. coli BL21（ DE3）中高效表达,间接法ELISA检测抗UL7抗体效价可达1∶105以上。 Western blot试验证明抗UL7多克隆抗体可以特异性识别UL7蛋白。在HSV-1病毒感染Vero细胞后的不同时间点均检测到了UL7蛋白的表达。结论成功获得GST-UL7融合蛋白,且制备了抗UL7蛋白的多克隆抗体,利用该抗体初步确定了UL7蛋白在HSV-1增殖过程中的不同时间点均有表达。

关键词：单纯疱疹病毒1型(HSV-1) UL7 原核表达多克隆抗体

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柯萨奇病毒B组2型(CVB2)病毒蛋白转染上皮细胞后诱导的免疫应答信号分子的特征分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2019年第5期39卷 321-326页

作者：牟唐维吴化叶柳蕾王建斌张莹李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的分析柯萨奇病毒B组2型(coxsackievirus B2,CVB2)病毒蛋白转染上皮细胞后诱导的免疫应答信号分子特征。方法构建CVB2结构蛋白重组真核表达质粒转染16HBE细胞,收集转染后的16HBE细胞培养上清和裂解物。利用RT-Q-PCR技术检测转染后的16... 详细信息

目的分析柯萨奇病毒B组2型(coxsackievirus B2,CVB2)病毒蛋白转染上皮细胞后诱导的免疫应答信号分子特征。方法构建CVB2结构蛋白重组真核表达质粒转染16HBE细胞,收集转染后的16HBE细胞培养上清和裂解物。利用RT-Q-PCR技术检测转染后的16HBE细胞中与固有免疫应答相关的信号分子的mRNA表达水平。利用ELISPOT检测转染后的16HBE细胞上清和裂解物与T细胞共培养后该T细胞的增殖效应。结果CVB2结构蛋白VP1~VP4转染16HBE细胞后与固有免疫相关的信号分子如TAK、NIK、IKKα、IFN-β等基因表达量均发生了不同程度的上调;CVB2 VP1~VP4转染后的16HBE细胞上清和裂解物与T细胞共培养发现,均能刺激T细胞增殖。结论CVB2结构蛋白VP1~VP4可以不同程度地激活与固有免疫相关信号分子的表达,并且对适应性免疫的激活具有促进作用。

关键词：柯萨奇病毒B组2型结构蛋白免疫应答

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固有淋巴细胞研究进展

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中华微生物学和免疫学杂志 2019年第5期39卷 389-395页

作者：王建斌李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

固有淋巴细胞(innate lymphoid cells,ILCs)是一群新近发现的具有适应性免疫功能的固有免疫细胞,分化源于共同淋巴祖细胞(common lymphoid progenitor,CLP),存在于全身多个组织中。根据其分泌的细胞因子和表达的转录因子可以分为3个亚群... 详细信息

固有淋巴细胞(innate lymphoid cells,ILCs)是一群新近发现的具有适应性免疫功能的固有免疫细胞,分化源于共同淋巴祖细胞(common lymphoid progenitor,CLP),存在于全身多个组织中。根据其分泌的细胞因子和表达的转录因子可以分为3个亚群:ILC1s、ILC2s和ILC3s,这些异质性免疫细胞群在机体不同组织中发挥着不同的作用,参与组织重塑、修复愈合,抗寄生虫、致病菌感染,并与肿瘤的发生、机体代谢的稳定以及共生菌免疫耐受的形成等有关。本文就ILC的分类、分化发育来源及最新功能研究进展做一综述。

关键词：固有淋巴细胞分类分化发育功能

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2017年深圳地区冬季诺如病毒基因分型与流行病学分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2018年第10期38卷 725-730页

作者：陈林林周艳林晓晨杜静刘洋汪艺李鸿钧中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所、云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的对深圳地区2017年冬季诺如病毒（Norovirus，NoV）流行株基因型、流行病学特点及同源性进行分析和研究。方法通过提取313份粪便样品的核酸后利用NoV特异性引物进行逆转录PCR（***），将阳性PCR产物测序。根据样品测序序列及NoV参考... 详细信息

目的对深圳地区2017年冬季诺如病毒（Norovirus，NoV）流行株基因型、流行病学特点及同源性进行分析和研究。方法通过提取313份粪便样品的核酸后利用NoV特异性引物进行逆转录PCR（***），将阳性PCR产物测序。根据样品测序序列及NoV参考株序列，利用软件Mega4．1及ClustMW构建系统发生树。结果NoV阳性样品共26份且均为GⅡ．4型，分别与GⅡ．4（KY407156）、GⅡ．4（KY580757）及GⅡ．4（KX372682）具有较高的同源性。此外，88．46％的NoV样品与本地区历年流行株同源性较低，且46．15％与我国其他地区流行株存在差异。结论2017年冬季深圳地区诺如病毒流行株以GⅡ．4型为主，且其在流行性及同源性上具有自身的特点．在当地公共卫生工作中需加强关注。

关键词：诺如病毒基因型系统发生树同源性分析

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HSV-1减毒株M3诱导的特异性免疫应答对HSV-2的交叉保护特征分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2021年第1期41卷 36-44页

作者：车雪阳李雪琦徐兴丽张莹王丽春廖芸程继帅牟唐维李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的本研究从血清学及临床保护角度探讨单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)和HSV-2免疫交叉反应的特征,以期为控制及预防这两种病毒引起的疾病提供数据资料。方法HSV-1减毒株M3免疫小鼠,检测其诱导产生以中和抗体为指... 详细信息

目的本研究从血清学及临床保护角度探讨单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)和HSV-2免疫交叉反应的特征,以期为控制及预防这两种病毒引起的疾病提供数据资料。方法HSV-1减毒株M3免疫小鼠,检测其诱导产生以中和抗体为指征的特异性免疫应答情况。免疫28 d后分别用HSV-1野毒株和HSV-2野毒株经不同途径对小鼠进行攻击感染,观察M3免疫小鼠抵御HSV-1/2病毒感染的情况。结果HSV-1减毒株M3免疫小鼠不能诱导产生特异性的抗HSV-2中和抗体,免疫28 d后接受不同途径的HSV-2攻击,病毒载量显著增加,但未出现明显的异常临床表现,同时组织病理损伤也仅表现为较轻微的炎性反应。HSV-1减毒株M3免疫小鼠能够诱导产生特异性的抗HSV-1中和抗体,并且在HSV-1野毒攻击后表现出明显的保护效果。结论HSV-1减毒株M3免疫小鼠后所诱导的免疫应答对HSV-1野毒株感染攻击表现出以中和抗体为特征的、可限制病毒在体内增殖的免疫保护作用,然而对HSV-2野毒株攻击则表现出不以抗体形式中和病毒而是以控制病毒的增长为主要模式的临床交叉免疫保护能力。

关键词：人类单纯疱疹病毒1型人类单纯疱疹病毒2型减毒株交叉保护

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