检索结果-内蒙古大学图书馆

中国生物制品学杂志 2016年第4期29卷 342-347,353页

作者：邓燕朱云梁海孝杨璐洁罗娜王虓宇王海杨卉娟徐明珏杨净思孙明波中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的分析Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliomyelitis vaccine,sabin strain,s IPV）毒种（亚主种子、工作种子）及疫苗代次病毒（SO＋4）的遗传稳定性。方法比较疫苗株SabinⅠ、Ⅱ型及PfizerⅢ型亚主种子、工作种子及疫苗... 详细信息

目的分析Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliomyelitis vaccine,sabin strain,s IPV）毒种（亚主种子、工作种子）及疫苗代次病毒（SO＋4）的遗传稳定性。方法比较疫苗株SabinⅠ、Ⅱ型及PfizerⅢ型亚主种子、工作种子及疫苗代次病毒的感染性滴度及D抗原含量的变化情况,并对上述病毒进行全基因组测序。结果各代次Sabin株病毒滴度均维持在7.62-8.62 lg CCID50/ml,D抗原含量均维持在30-128 DU/ml。与Gen Bank上登录的SabinⅠ（AY184219.1）、Ⅱ（AY184220.1）、Ⅲ型（AY184221.1）减毒株原始种子（SO）基因序列相比,Sabin株亚主种子（SO＋2）、工作种子（SO＋3）及疫苗代次病毒（SO＋4）均未出现碱基突变。结论 s IPV毒种及疫苗代次病毒的全基因序列与原始种子相比,均未发生变化,毒力均一,遗传性状方面保持了较好的稳定性。

关键词： Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗全基因组测序遗传稳定性

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2017年云南省登革病毒Ⅰ型分离株NS1基因的鉴定及分析

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中国生物制品学杂志 2018年第5期31卷 456-461页

作者：文送娇林垚席珏敏王晓丹陈俊英潘玥叶超管娇琼洪姗孙强明中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的鉴定并分析2017年云南省登革病毒Ⅰ型(dengue virusⅠ,DENVⅠ)分离株的NS1基因。方法采用病毒RNA提取试剂盒提取登革热(dengue fever,DF)患者血清RNA,RT-PCR法鉴定病毒类型,并扩增DENVⅠ的NS1基因,进行测序。应用BIOEDIT软件比对NS1... 详细信息

目的鉴定并分析2017年云南省登革病毒Ⅰ型(dengue virusⅠ,DENVⅠ)分离株的NS1基因。方法采用病毒RNA提取试剂盒提取登革热(dengue fever,DF)患者血清RNA,RT-PCR法鉴定病毒类型,并扩增DENVⅠ的NS1基因,进行测序。应用BIOEDIT软件比对NS1及DENVⅠ标准株(DQ672562.1)的核苷酸及氨基酸序列,并进行突变分析。应用MEGA 5.1软件中的NJ法(1000 Boot strap replicate)构建NS1基因的系统进化树。结果共分离获得16株DENVⅠ的NS1基因,经比对发现,201703、201704、201708、201709、201713分离株NS1基因第21位碱基由C变为T(无义突变);201705、201706、201712分离株NS1基因第289位碱基由T变为A(有义突变),氨基酸曲L变为M。16株分离株NS1基因其他突变位点均相同,共85处发生碱基突变,其中5个为有义突变。16株分离株与2011-China Donggua(JQ048541.1)、2008-Singapore(GU370049.2)、2014-Taiwan(KU365900.1)、2005-China Fujian(DQ193572.1)、2016-Malaysia(KX452065.1)、2007-Indonesia(KC762646.1)、2015-South Korea(KP406802.1)、2006-Japan(AB178040.1)、2007-Thailand(HM469966.1)、2013-singapore(KJ806945.2)有较近的亲缘关系。结论 2017年云南省16株分离毒株均为DENVⅠ,可能属于东南亚国家的输入性毒株。

关键词：登革病毒 NS1基因基因突变系统进化分析

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人二倍体细胞对不同病毒感染过程的生物学效应比较分析

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中国生物制品学杂志 2016年第9期29卷 907-912页

作者：王辉张莹刘龙丁廖芸王建斌胡雅洁王丽春赵婷王艳翠李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的分析人二倍体细胞对不同病毒感染的生物学反应差异性及相关分子生物学机制。方法用人类肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和人单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)感染人二倍体细胞,光镜和电镜下观察感染细胞形态... 详细信息

目的分析人二倍体细胞对不同病毒感染的生物学反应差异性及相关分子生物学机制。方法用人类肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和人单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)感染人二倍体细胞,光镜和电镜下观察感染细胞形态学特征;比较两种病毒在人二倍体细胞上的增殖动力学及两种病毒感染后细胞酶谱的变化;采用基因芯片检测两种病毒感染后人二倍体细胞基因反应的差异。结果感染细胞的光镜或电镜的超微结构观察均表现出许多相同的特点,包括细胞变圆、肿胀、折光性增强,以及细胞细微结构的受损,大多数细胞器的破坏等。两种病毒在人二倍体细胞上具有不同滴度峰值的增殖动力学过程;对细胞超氧化物歧化酶的动力学改变趋势有不同影响,但对乳酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶动力学变化趋势无明显影响;两种病毒感染引起人二倍体细胞出现不同的基因反应,其中与信号转导及与天然免疫反应有关的mRNA转录效率具有一定的差异。结论人二倍体细胞对EV71、HSV-1感染过程表现不同的生物学效应。

关键词：二倍体细胞肠道病毒71型单纯疱疹病毒1型酶谱基因表达谱

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树鼩CD4及IL-6分子的克隆及分析

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中国生物制品学杂志 2015年第6期28卷 579-586页

作者：任芳芳徐婧雯张雪梅吴忠香马娜卢孔杰董少忠中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的克隆野生型中缅树鼩的CD4及IL-6分子,并分析其核苷酸、氨基酸序列的多态性及重要的功能位点。方法经野生型树鼩尾静脉采血,分离外周血单核淋巴细胞,经植物血球凝集素(phytohemagglutinin,PHA)刺激24 h后,提取细胞总RNA,以其为模板,... 详细信息

目的克隆野生型中缅树鼩的CD4及IL-6分子,并分析其核苷酸、氨基酸序列的多态性及重要的功能位点。方法经野生型树鼩尾静脉采血,分离外周血单核淋巴细胞,经植物血球凝集素(phytohemagglutinin,PHA)刺激24 h后,提取细胞总RNA,以其为模板,进行RT-PCR扩增,扩增产物插入p MD-19T载体,提取阳性重组质粒,经双酶切鉴定及测序;采用Lasergene分析目的基因核苷酸及氨基酸序列,并构建进化树,分析野生型树鼩与已知中缅树鼩的亲缘关系。结果野生型树鼩CD4全长编码序列的开放阅读框长度为1 365 bp,编码454个氨基酸,IL-6全长编码序列的开放阅读框为627 bp,编码208个氨基酸,22只野生型树鼩成功克隆出CD4分子,23只野生型树鼩成功克隆出IL-6分子。不同野生型中缅树鼩的CD4及IL-6分子有不同程度的核苷酸和氨基酸位点的突变,但分别有35%和26.7%的碱基突变为同义突变,且发生非同义突变的位点对树鼩CD4和IL-6分子重要的功能位点无影响。由CD4核苷酸及氨基酸序列构建的系统进化树基本一致;由IL-6核苷酸及氨基酸序列构建的系统进化树中,23只野生树鼩分为2个分支。结论 CD4和IL-6分子具有重要功能的氨基酸位点是保守稳定的,为今后树鼩CD4和IL-6单克隆抗体的制备及树鼩实验动物模型的建立奠定了基础。

关键词：树鼩 CD4 IL-6 克隆系统进化树

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试验设计法优化肺炎支原体培养基

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中国生物制品学杂志 2019年第1期32卷 66-71页

作者：李双丽李泽华朱文勇陈枫李卫东廖国阳中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的试验设计(design of experiment,DOE)法优化肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)培养基,以期提高MP产量。方法以MP(FH株)为试验菌株,PPLO培养基为基础,菌体蛋白含量为响应值,采用Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验及Box-Behnken试验对脑心浸液、水解乳蛋白、胨3号、精氨酸、小牛胸腺DNA、葡萄糖和胰蛋白胨7种培养基添加成分进行筛选及优化。以菌体蛋白含量及颜色变化单位(color change unit,CCU)为指标,验证改良培养基培养MP的效果。结果培养基各添加成分对MP生长影响作用大小依次为葡萄糖、胰蛋白胨、脑心浸液、精氨酸、月胨3号、水解乳蛋白、小牛胸腺DNA,最终筛选出脑心浸液、葡萄糖及胰蛋白胨3种添加物,最适浓度分别为5. 68、1. 34及2. 64 g/L。采用改良培养基培养MP 96 h时,菌体蛋白含量及CCU达最大,分别为851. 29μg/mL及10~9 ccu/mL。结论 DOE法实现了对MP培养基的优化,获得了影响MP生长的主要参数,提高了MP菌体产量。

关键词：肺炎支原体 PPLO培养基试验设计优化

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树鼩白细胞介素-6的原核表达及其分子特征

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中国生物制品学杂志 2015年第6期28卷 557-563页

作者：冯凯李建平胡云光王晶晶王丽春李剑兰李琦涵刘龙丁中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的原核表达树鼩(tree shrew,ts)白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)基因,并分析ts IL-6蛋白分子特征。方法以人、猴、啮齿类动物等IL-6 m RNA的共有序列作为查询序列,从树鼩c DNA数据库中进行本地blast,获得预测ts IL-6核苷酸序列,将... 详细信息

目的原核表达树鼩(tree shrew,ts)白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)基因,并分析ts IL-6蛋白分子特征。方法以人、猴、啮齿类动物等IL-6 m RNA的共有序列作为查询序列,从树鼩c DNA数据库中进行本地blast,获得预测ts IL-6核苷酸序列,将其翻译成氨基酸序列,用MEGA 6软件进行核酸序列和氨基酸序列比对,绘制进化树。参考预测IL-6基因序列设计引物,PCR扩增IL-6基因序列,克隆至原核表达载体p ET-28a(+),构建重组表达质粒p ET-28a(+)-IL-6;转化感受态*** BL21(ED3),IPTG诱导表达,重组蛋白经14 KD透析膜梯度透析纯化;利用蛋白质在线数据库expasy进行蛋白质结构同源建模,并用Signal P sever预测ts IL-6的信号肽序列,经模板与预测模型的结构拟合来预测树鼩IL-6的gp130结合位点。结果 ts IL-6核苷酸和氨基酸序列与高等灵长类动物有较高的同源性;重组表达质粒p ET-28a(+)-IL-6经双酶切鉴定证明构建正确;重组表达蛋白相对分子质量约为24 000,纯化后可见单一目的条带,浓度为0.2 mg/ml;h IL-6和ts IL-6蛋白的空间结构较类似,ts IL-6的gp130结合位点Ⅱa位于A和C螺旋间,位点Ⅲa位于A和B螺旋的柔性链区及分子近C-端。结论 ts IL-6的核苷酸和氨基酸序列与高等灵长类动物具有较高同源性,成功构建的重组原核表达质粒p ET-28a(+)-IL-6,为后续IL-6相关的病理研究奠定了基础。

关键词：树鼩白细胞介素-6 原核细胞基因表达同源建模

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Benzonase酶去除流感疫苗中Vero细胞DNA条件的优化

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中国生物制品学杂志 2017年第5期30卷 540-545页

作者：徐国峰耿兴良宋绍辉马磊廖国阳李卫东中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的优化非限制性内切酶Benzonase去除Vero细胞制备的H5N1流感疫苗中残余细胞DNA的条件,并结合两步柱层析法使疫苗中DNA残余达到质量要求。方法向H5N1流感病毒浓缩液中添加不同终浓度的Benzonase酶(10、20、30、40、50、60 U/ml),置于3... 详细信息

目的优化非限制性内切酶Benzonase去除Vero细胞制备的H5N1流感疫苗中残余细胞DNA的条件,并结合两步柱层析法使疫苗中DNA残余达到质量要求。方法向H5N1流感病毒浓缩液中添加不同终浓度的Benzonase酶(10、20、30、40、50、60 U/ml),置于37℃酶解不同时间(0.5、1、1.5、2、2.5、3 h),经100 k D超滤离心管,用不同p H(7.10、7.30、7.50、7.70、7.90)的PBS进行洗滤浓缩。将Benzonase酶处理的病毒液经蔗糖密度梯度离心纯化,去除部分杂蛋白,电镜下观察病毒的形态。结合两步柱层析法进一步去除Vero细胞DNA。结果 H5N1流感病毒液经终浓度为10 U/ml的Benzonase酶,37℃处理2.5 h后,用p H为7.50的PBS溶液进行洗滤,其DNA去除率可达99%以上。Benzonase酶处理前后病毒形态一致,结构完整,轮廓清晰。在用酶处理去除原液中大部分Vero细胞残余DNA的基础上,结合两步柱层析法基本可使疫苗残余外源DNA达到100 pg/剂的限定标准。结论非限制性核酸内切酶Benzonase可高效降解H5N1流感病毒液中的DNA,此方法降低流感疫苗中Vero细胞DNA简单可行,大大降低了后续工艺去除DNA的压力,同时结合两步柱层析法可使疫苗中DNA残余达到限定标准,为以Vero细胞为基质大流行流感疫苗的研发奠定了基础。

关键词： Benzonase酶 H5N1流感病毒 Vero细胞 DNA 超滤柱层析

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天麻素在甲基苯丙胺诱导SH-SY5Y细胞自噬中的作用及机制研究

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中国药理学通报 2018年第4期34卷 577-583页

作者：杨根梦李娟洪仕君薛凤麟何永旺周一卿曾晓锋李利华昆明医科大学法医学院云南昆明650500 中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的研究天麻素(gastrodin)在甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)诱导SH-SY5Y细胞自噬中的作用,并探讨其作用机制。方法体外培养人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,不同浓度的METH(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol·L^(-1))处理SY5Y细胞... 详细信息

目的研究天麻素(gastrodin)在甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)诱导SH-SY5Y细胞自噬中的作用,并探讨其作用机制。方法体外培养人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,不同浓度的METH(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol·L^(-1))处理SY5Y细胞,并在6、12、24、48 h观察SY5Y细胞自噬的情况,确定自噬的最佳浓度和时间点。提前1 h给予1mmol·L^(-1)天麻素进行干预,用显微镜观察细胞形态变化,采用激光共聚焦显微镜观察LC3-Ⅱ的改变,Western blot检测天麻素干预前后LC3-Ⅱ、Beclin-1以及Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表达情况。结果随着METH浓度(0~3.0 mmol·L^(-1))的增加,SY5Y细胞逐渐变圆、突起逐渐变短、消失,同时部分细胞质内可见大小不等的空泡结构形成,细胞间隙逐渐增宽,最终细胞呈漂浮状态。随着METH浓度的增加,SY5Y细胞LC3-Ⅱ表达水平逐渐增强。激光共聚焦显微镜结果显示,天麻素+METH组LC3-Ⅱ的表达水平比METH组降低。与对照组相比,METH组LC3-Ⅱ和Beclin-1表达水平明显增强(P<0.01),mTOR和Akt差异无显著性,p-mTOR、p-Akt表达水平明显降低(P<0.01);给予天麻素干预后,与METH组相比,LC3-Ⅱ和Beclin-1表达水平降低,而mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt表达水平升高。结论 METH可诱导SY5Y细胞自噬,天麻素可减弱METH诱导的SY5Y细胞自噬,这一作用与天麻素调控Akt和mTOR信号通路密切相关。

关键词：甲基苯丙胺 SH-SY5Y细胞天麻素自噬神经毒性信号通路

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EV71两种结构形式的免疫学特性比较

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中国生物制品学杂志 2014年第11期27卷 1388-1393页

作者：程晨冯敏杨二霞普晶崔萍芳张莹李建平陈姝樾王丽春赵树栋王晶晶李剑兰刘龙丁李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的分析肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）在病毒增殖的动力学过程中不同时间点的病毒样品所具有的两种结构形式及免疫学特性,为疫苗的研发及质控提供参考。方法利用Opti Prep密度梯度离心获得EV71两种结构形式,电镜扫描观察两种结... 详细信息

目的分析肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）在病毒增殖的动力学过程中不同时间点的病毒样品所具有的两种结构形式及免疫学特性,为疫苗的研发及质控提供参考。方法利用Opti Prep密度梯度离心获得EV71两种结构形式,电镜扫描观察两种结构形式的颗粒形态;采用病毒微量滴定法测定病毒两种结构形式的感染性滴度;EV71抗原生物素-亲和素酶联免疫（BA-ELISA）方法测定病毒两种结构形式的抗原含量;QRT-PCR法测定两种结构形式的病毒RNA含量;SDS-PAGE及Western blot鉴定病毒两种结构形式。将分离得到的空壳及实心病毒颗粒成分用甲醛灭活后,与Al（OH）3佐剂混合,对小鼠进行皮下多点注射,分别于初免28 d及二免7、14 d,经小鼠尾静脉采血,分离血清,采用微量中和试验法检测抗EV71中和抗体;将二免14 d后的雄、雌鼠合笼,生产后24 h内,用EV71FY-23对乳鼠进行颅内注射,10 d内观察乳鼠存活率。结果经Opti Prep密度梯度离心后,可获得两条沉降系数不同的病毒条带,位于上层的病毒结构成份基本以空心衣壳颗粒形式存在;下层病毒结构成分在感染前期主要为以实心颗粒形式存在,感染后期则以空壳和实心颗粒同时存在,两种结构形式均能被抗EV71特异血清识别。在病毒感染过程中,下层毒粒感染性滴度均比上层毒粒高2~3个log值;两种结构形式的抗原滴度均呈增加的趋势,但下层毒粒抗原滴度增加更为明显;病毒两种结构形式两层的RNA含量不同,下层毒粒中VP0均已裂解形成VP2和VP4,而上层毒粒中以VP0为主要成分。初免后28 d及二免后7、14 d,两种结构形式的EV71均诱导小鼠抗体阳转,但上层毒粒诱导的中和抗体效价及增长速度均明显低于下层毒粒（P均〈0.001）。病毒两种结构形式免疫小鼠产生的乳鼠免疫保护效率均为100%。结论 EV71的两种结构形式虽然具有差异,但作为病毒疫苗抗原用于免疫时,均具有免疫学意义。

关键词：肠道病毒71型结构形式免疫学特性

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两种凝胶过滤介质纯化Sabin株脊髓灰质炎病毒效果的比较

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中国生物制品学杂志 2017年第10期30卷 1086-1091,1095页

作者：王虓宇朱云沈武玲平玲蔡玮孙明波中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的比较两种不同的凝胶过滤介质对Sabin株脊髓灰质炎病毒的分离纯化效果。方法将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒收获液各3批经超滤浓缩后,分别采用Sepharose CL-6B和Sepharose 6FF填料进行凝胶过滤纯化,分段收集各纯化峰,检测D抗... 详细信息

目的比较两种不同的凝胶过滤介质对Sabin株脊髓灰质炎病毒的分离纯化效果。方法将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒收获液各3批经超滤浓缩后,分别采用Sepharose CL-6B和Sepharose 6FF填料进行凝胶过滤纯化,分段收集各纯化峰,检测D抗原及蛋白含量,计算比活性、蛋白去除率及抗原回收率,确定病毒峰收集范围。取抗原含量最高的病毒收获液,利用DEAE Sepharose FF离子交换填料进行纯化后,检测Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量。结果 Sepharose 6FF填料按6%柱体积上样进行凝胶纯化,纯化的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒收获液抗原回收率均值分别为78.69%、78.03%和78.37%,与Sepharose CL-6B填料按3%柱体积上样(77.29%、78.60%和77.36%)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。两种填料纯化的各型收获液再经离子交换纯化后,蛋白去除率、比活性、Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量检测结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求,两种填料纯化的各型收获液比活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论使用Sepharose 6FF纯化的各型病毒纯化液抗原回收率和比活性与Sepharose CL-6B无明显差异,但可以减少纯化的上样次数,大幅提高纯化效率,可用Sepharose 6FF替换Sepharose CL-6B。

关键词：脊髓灰质炎病毒层析纯化凝胶过滤离子交换

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