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人蜕膜间充质干细胞来源外泌体对高糖老化人真皮成纤维细胞功能的影响及其可能机制

中华烧伤与创面修复杂志 2022年第2期38卷 170-183页

作者：苏建隆马奎张翠萍付小兵南开大学医学院天津300071 解放军总医院医学创新研究部创伤修复与组织再生研究中心北京100853 中国医学科学院严重创伤救治和组织修复与再生医学创新单元2019RU051 北京100048

目的建立人真皮成纤维细胞(HDF)高糖老化模型,探讨人蜕膜间充质干细胞(dMSC)来源外泌体对高糖老化HDF增殖、迁移、凋亡的影响及其可能机制。方法采用实验研究方法。收集2021年1—3月解放军总医院第四医学中心收治的4例男性包茎患者(18~2... 详细信息

目的建立人真皮成纤维细胞(HDF)高糖老化模型,探讨人蜕膜间充质干细胞(dMSC)来源外泌体对高糖老化HDF增殖、迁移、凋亡的影响及其可能机制。方法采用实验研究方法。收集2021年1—3月解放军总医院第四医学中心收治的4例男性包茎患者(18~22岁)环切术后废弃包皮组织,分离培养获取原代HDF。取第6代HDF,按照随机数字表法分为低糖组和高糖组,分别采用低糖完全培养基和高糖完全培养基进行每72小时换液、不传代培养,10 d后取细胞,于接种后24 h,采用β-半乳糖苷酶试剂盒检测细胞衰老情况;于接种后48 h,采用蛋白质印迹法检测细胞衰老相关蛋白p16、p53表达情况;于接种后24、48、72 h,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞增殖情况;于接种后48 h,采用脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色法检测细胞增殖情况,采用流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况;于接种后24 h,采用Transwell实验测定细胞迁移能力。取人dMSC培养48~72 h,采用差速高速离心法获取其外泌体,采用透射电子显微镜观察dMSC外泌体形态,采用纳米颗粒追踪分析法检测dMSC外泌体的粒径分布,采用蛋白质印迹法检测dMSC外泌体标志蛋白CD9、肿瘤易感基因101(TSG101)的表达。取dMSC外泌体及前述高糖完全培养基诱导老化的HDF共孵育24 h,采用PKH67试剂盒检测细胞摄取外泌体的情况。取前述高糖完全培养基诱导老化的HDF,同前分为单纯高糖组、高糖+低浓度外泌体组、高糖+高浓度外泌体组,分别于高糖完全培养基中加入等体积的磷酸盐缓冲液、终质量浓度为50μg/mL dMSC外泌体、终质量浓度为100μg/mL dMSC外泌体进行常规细胞培养。分组后同前于对应时间点采用CCK-8法和EdU染色法、流式细胞术、Transwell实验分别检测细胞增殖、细胞周期和凋亡及细胞迁移情况。根据前述结果,另取经高糖完全培养基诱导老化的HDF,分为单纯高糖组、高糖+高浓度外泌体组并同前处理。分组培养48 h,采用实时荧光定量反转录PCR法检测单纯高糖组和高糖+高浓度外泌体组细胞衰老相关的微小RNA-145-5p(miR-145-5p)、miR-498、miR-503-5p及其靶基因钙/钙调素依赖性蛋白激酶1D(CAMK1D)、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN基因)和细胞周期蛋白D1的mRNA表达情况。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD-t检验和独立样本t检验。结果接种后24 h,高糖组HDFβ-半乳糖苷酶阳性染色率为(38.4±4.2)%,明显高于低糖组的(16.5±2.2)%(t=4.65,P<0.01)。接种后48 h,高糖组HDF的衰老相关蛋白p16和p53的表达量均明显高于低糖组(t值分别为11.85、3.02,P<0.05或P<0.01)。接种后24、48、72 h,高糖组HDF的增殖活性均明显低于低糖组(t值分别为4.13、9.90、15.12,P<0.01)。接种后48 h,高糖组HDF的EdU阳性染色率明显低于低糖组(t=3.83,P<0.05)。接种后48 h,高糖组HDF周期的G2/M+S亚群在3个亚群(G0/G1、S和G2/M)的占比明显低于低糖组(t=8.74,P<0.01)。接种后24 h,高糖组HDF穿过Transwell滤膜到达下室的细胞数量为(37±6)个,明显少于低糖组的(74±7)个(t=8.42,P<0.01)。接种后48 h,高糖组HDF凋亡率明显高于低糖组(t=8.48,P<0.01)。dMSC外泌体为边缘清晰、大小分布均匀的杯状或者圆形囊泡,粒径基本处于80~200 nm。dMSC外泌体标志性蛋白CD9、TSG101表达均呈阳性。共孵育24 h,外泌体被HDF摄入胞内,主要分布于细胞核周围。分组培养24、48、72 h,高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于单纯高糖组(t值分别为6.36、6.10、7.76,8.92、12.17、10.74,P<0.01),高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于高糖+低浓度外泌体组(t值分别为7.92、4.82、4.72,P<0.01)。分组培养48 h,与单纯高糖组比较,高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率均明显升高(t值分别为5.32、9.88,P<0.01);与高糖+低浓度外泌体组比较,高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率显著升高(t=5.27,P<0.01)。分组培养48 h,与单纯高糖组比较,高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF中的G0/G1期亚群占比均显著降低(t值分别为3.81、4.31,P<0.05),G2/M+S亚群占比均明显升高(t值分别为3.

关键词：间质干细胞外泌体细胞衰老葡萄糖溶液,高渗成纤维细胞

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自制毛囊再生乳膏对小鼠皮肤创面毛囊再生的影响

引用

解放军医学院学报 2021年第3期42卷 319-326页

作者：孙浩汤茂孙梦黎秦华马奎梅谨瑜赵安东付小兵解放军总医院医学创新研究部创伤修复和组织再生研究中心北京100853 解放军总医院第四医学中心全军创伤修复与组织再生重点实验室皮肤损伤修复与组织再生北京市重点实验室北京100048 天津医科大学天津300070 中国医学科学院严重创伤救治和组织修复与再生医学创新单元北京100048 解放军总医院第一医学中心组织再生与创面修复科北京100853

背景创面愈合时无毛囊等皮肤附属器再生是创面修复领域的难题。小分子化合物能够调控细胞增殖与分化,促使成熟体细胞再分化为具有增殖能力的前体细胞或其他细胞系,还能够靶向调控信号通路与代谢进程,是一种促进皮肤及附属器原位再生的... 详细信息

背景创面愈合时无毛囊等皮肤附属器再生是创面修复领域的难题。小分子化合物能够调控细胞增殖与分化,促使成熟体细胞再分化为具有增殖能力的前体细胞或其他细胞系,还能够靶向调控信号通路与代谢进程,是一种促进皮肤及附属器原位再生的安全有效的方法。目的本研究拟通过小分子化合物组合探索其促进创面毛囊再生的效果及机制。方法选取C57BL/6小鼠45只,雌性,体质量(20±5)g。以打孔器配合眼科剪制作小鼠背部双侧皮肤全层缺损创面动物模型,左侧创面为用药侧,右侧创面为对照侧。以负载CHIR-99021、Purmorphamine、Tofacitinib和SJ000291942四种小分子化合物的凡士林药膏(以下简称毛囊再生乳膏)连续涂抹小鼠背部皮肤全层缺损创面28 d,通过常规HE染色、Masson染色以及免疫组织化学染色分析创面愈合和毛囊再生情况。结果用药组与对照组小鼠背部创面愈合率无统计学差异,提示毛囊再生乳膏对创面愈合速度无显著影响。HE染色发现,毛囊再生乳膏处理创面14 d左右,用药组创面表皮形成毛囊上皮芽基细胞,真皮中出现毛乳头细胞。28 d可见用药组创面中大量毛囊样结构,免疫荧光染色证实其表达毛囊细胞特征性标志物CK5、CK15、CK17、Noggin,而对照组创面毛囊再生数量极少,用药组与对照组新生毛囊数量差异有统计学意义(17 vs 4,P<0.001)。Masson染色可见用药组与对照组创面胶原纤维密度及排列方式无明显区别,提示毛囊再生乳膏可诱导纤维瘢痕中毛囊再生。免疫组织化学染色显示用药侧创面新生的表皮细胞、毛囊上皮芽基细胞、新生毛乳头细胞中Wnt信号通路和Shh信号通路相关标志物β-catenin、Shh、Gli1显色明显,表明毛囊再生乳膏可能通过激活Wnt、Shh信号通路促进创面毛囊再生。结论本研究自制的毛囊再生乳膏能够通过调控毛囊生长发育过程中的Wnt信号通路和Shh信号通路促进创面愈合时毛囊再生,有望转化为创面治疗药物应用于临床。

关键词：小鼠皮肤创面小分子化合物CHIR-99021 小分子化合物Purmorphamine 小分子化合物Tofacitinib 小分子化合物SJ000291942 毛囊再生

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