在前期研究中本实验室构建了敲除H3(Hypothetical protein 3)基因的非洲猪瘟病毒(ASFV)毒株,并进一步通过动物实验表明敲除该基因对于ASFV的毒力没有影响,推测该蛋白可能是ASFV的非结构蛋白。为进一步了解ASFVH3基因及其编码蛋白的理化...
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在前期研究中本实验室构建了敲除H3(Hypothetical protein 3)基因的非洲猪瘟病毒(ASFV)毒株,并进一步通过动物实验表明敲除该基因对于ASFV的毒力没有影响,推测该蛋白可能是ASFV的非结构蛋白。为进一步了解ASFVH3基因及其编码蛋白的理化性质和结构特征,从NCBI数据库中搜集到71株包含H3基因的ASFV毒株进行序列比对并绘制了H3基因的分子进化树。利用在线软件分析ASFV H3蛋白的理化性质和组成结构,通过在HEK-293T细胞中转染真核表达质粒pRK-H3-GFP确定其亚细胞定位。结果表明,H3基因在Ⅰ型和Ⅱ型ASFV毒株中具有较高的同源性。H3蛋白包含35个氨基酸,等电点为5.49,相对分子质量为8648.38,氨基酸组成中丙氨酸、苏氨酸含量分别占37.1%、34.3%;其二级结构中,α-螺旋、β-折叠、无规卷曲分别占37.14%、25.71%、25.71%。制备了该蛋白的多克隆抗体,用荧光显微镜验证ASFV H3蛋白的表达。通过核定位序列预测该蛋白定位于细胞质和细胞核中;构建H3蛋白的真核表达质粒,通过间接免疫荧光试验证实该蛋白定位于细胞质和细胞核。这为进一步揭示H3基因功能奠定了一定基础,也为后续深入探讨H3基因功能提供了理论依据。
目的:分析芒果苷(mangiferin)联合硼替佐米对人Burkitt淋巴瘤Raji细胞增殖、侵袭、凋亡和自噬的作用及对CXC趋化因子受体家族(CXCR)表达的影响,并探究其间存在的分子机制,为Burkitt淋巴瘤基础研究与临床提供科学依据。方法:采用不同浓度Mangiferin、硼替佐米单药或联合干预Raji细胞,利用CCK-8法检测细胞增殖,Transwell小室法检测细胞侵袭能力,Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡、自噬及Akt/m TOR通路蛋白表达情况,实时荧光定量PCR检测CXCR家族的表达变化。结果:不同浓度Mangiferin干预Raji细胞不同时间后,可抑制Raji细胞活力,且呈浓度及时间依赖性(r=-0.682,r=-0.836);与单药组相比,Mangiferin联合硼替佐米干预Raji细胞时,细胞增殖与侵袭能力显著下降、凋亡水平显著升高(P<0.01)。Mangiferin联合硼替佐米干预Raji细胞后,可上调促凋亡蛋白Bax表达并显著下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,同时亦使Caspase-3水解活化,继而诱导Raji细胞发生凋亡。Mangiferin联合硼替佐米干预Raji细胞后可上调LC3Ⅱ蛋白的表达,且细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值较单药或对照组显著上调(P<0.01)。Mangiferin联合硼替佐米可显著抑制Akt和m TOR的磷酸化水平,通过抑制Akt/m TOR通路来使Raji细胞增殖及侵袭受抑,并诱导细胞发生自噬与凋亡。Mangiferin及硼替佐米单药干预Raji细胞后,可下调CXCR4、CXCR7 m RNA的表达,当两药联合时CXCR4、CXCR7 m RNA表达下调更为显著(P<0.01)。Mangiferin单药或联合硼替佐米干预Raji细胞后CXCR5 m RNA表达无显著变化(P>0.05),但两药联合时可使CXCR3表达下调(P<0.05)。结论:Mangiferin联合硼替佐米能协同抑制Raji细胞增殖、侵袭,并诱导其发生自噬与凋亡,机制可能与抑制Akt/m TOR信号通路并通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2和上调促凋亡蛋白Bax以及使CXCR家族表达受抑等有关。
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