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去除Etag标记的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体原核表达载体的构建及表达

细胞与分子免疫学杂志 2007年第10期23卷 946-949页

作者：刘娟妮高瀛岱王金宏邵晓枫范冬梅纪庆熊冬生杨纯正中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020

目的:构建和表达不带Etag标记的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体(Diabody[CD3×Pgp]),并测定其生物学活性。方法:利用PCR方法构建不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]原核表达载体,进行原核表达,制备抗抗CD3scFv亲和层析柱进行纯化,SDS-PAG... 详细信息

目的:构建和表达不带Etag标记的抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体(Diabody[CD3×Pgp]),并测定其生物学活性。方法:利用PCR方法构建不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]原核表达载体,进行原核表达,制备抗抗CD3scFv亲和层析柱进行纯化,SDS-PAGE鉴定。通过间接免疫荧光法和竞争性免疫荧光结合流式细胞术(FCM)检测生物学活性。结果:无Etag的Diabody[CD3×Pgp]表达载体经测序证实其序列正确。SDS-PAGE电泳显示2条带,相对分子质量(Mr)分别为25000和26000,与预期Mr相符。去除Etag的Dia-body[CD3×Pgp]与K562/A02和Jurkat细胞结合阳性率分别为89.87%和83.95%。竞争结合实验中,与K562/A02和Jurkat细胞竞争后结合率分别为50.25%和43.78%。结论:成功构建了不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]表达载体、进行原核表达及纯化。不带Etag的Diabody[CD3×Pgp]能特异性结合CD3和Pgp靶抗原,Etag标记去除后其生物学活性没有降低。

关键词： PgP CD3 Diabody 基因工程抗体

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54例高危侵袭性T细胞非霍奇金淋巴瘤的回顾性分析

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中华血液学杂志 2007年第7期28卷 454-457页

作者：袁晓莉李桥川邹德慧赵耀中王亚非王迎张静薇邱录贵中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020

目的探讨高危侵袭性 T 细胞非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)的临床特征、治疗与预后。方法对国际预后指数(IPI)评分为中高危或高危的54例侵袭性 T-NHL 患者,按 WHO 分类标准分型,对其进行回顾性分析。结果 T 淋巴母细胞淋巴瘤(TLBL)12例(22.2%),... 详细信息

目的探讨高危侵袭性 T 细胞非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)的临床特征、治疗与预后。方法对国际预后指数(IPI)评分为中高危或高危的54例侵袭性 T-NHL 患者,按 WHO 分类标准分型,对其进行回顾性分析。结果 T 淋巴母细胞淋巴瘤(TLBL)12例(22.2%),非特殊型外周 T 细胞淋巴瘤(PTCL-U)31例(57.4%),肝脾 T 细胞淋巴瘤(HSTCL)11例(20.4%)。IPI 评分中高危12例(22.2%),高危42例(77.8%);其中侵犯骨髓49例(90.7%),侵犯脑膜7例(13.0%)。治疗总体反应率为86.5%,完全缓解率为67.3%,3年总生存(OS)率为16.0%;采取造血干细胞移植治疗的患者3年 OS 率为44.4%,明显高于化疗组(8.3%)。多因素分析显示治疗方案的选择、能否达缓解是影响预后的重要因素。结论 T-NHL 是一组高度异质性肿瘤。中高危、高危 T-NHL,尤其是 PTCL-U 和TLBL,虽然化疗反应率较高,但远期疗效很差,需要探索新的治疗方案,自体造血干细胞移植可能是较好的选择。

关键词：淋巴瘤,非霍奇金肿瘤治疗方案预后回顾性研究

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急性早幼粒细胞白血病治疗的远期疗效观察

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中华血液学杂志 2007年第1期28卷 15-18页

作者：张莉李睿李大鹏刘永泽徐世才郝玉书肖志坚中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020

目的观察急性早幼粒细胞白血病（APL）治疗的远期疗效。方法对初诊APL患者用全反式维甲酸（ATRA）诱导缓解治疗，完全缓解（CR）后给予3～4个疗程巩固联合化疗，达分子生物学缓解后用ATRA和巯嘌呤（6-MP）＋甲氨蝶呤（MTX）交替维持治疗... 详细信息

目的观察急性早幼粒细胞白血病（APL）治疗的远期疗效。方法对初诊APL患者用全反式维甲酸（ATRA）诱导缓解治疗，完全缓解（CR）后给予3～4个疗程巩固联合化疗，达分子生物学缓解后用ATRA和巯嘌呤（6-MP）＋甲氨蝶呤（MTX）交替维持治疗2年，在完成巩固治疗后及随后的4～5年用筑巢式RT—PCR检测PML—RARα融合基因定期监测微量残留病。结果共81例APL患者，75例（92．6％）达到CR，早期死亡（ED）率6．6％，ED患者确诊时外周血白细胞计数及早幼粒细胞比例明显高于CR者（P〈0．05）。65例（80．2％）患者接受了诱导缓解后巩固化疗，60例（92．3％）患者在3个疗程化疗后PML—RARα融合基因转阴，3例（4．6％）患者第4疗程结束后PML—RARα融合基因转阴。中位随访21．2（8．0～64．0）个月，血液学复发6例，复发率9．2％。Kaplan—Meier分析5年总生存（OS）率（86．6±4．6）％。65例接受了诱导缓解后巩固化疗的患者，5年无复发生存（RFS）率为82．7％。COX回归分析表明白细胞增高（〉10×10^9／L）为影响患者OS的惟一不利因素。结论经系统治疗80％以上的APL可望获得长期无复发生存。

关键词：白血病,早幼粒细胞,急性治疗结果

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123例多发性骨髓瘤患者的预后因素分析

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中华血液学杂志 2007年第5期28卷 330-334页

作者：徐燕邓书会麦玉洁李新漆佩静赵耀中邹德慧王亚非钱林生邱录贵中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020

目的评价生物学因素及治疗相关因素对多发性骨髓瘤（MM）患者的预后价值。方法生存分析采用Kaplan—Meier方法，各组之间生存的比较采用fog—rank检验；COX回归分析用于评估独立预后因素。结果①单因素分析显示：骨髓活检以原始幼稚浆... 详细信息

目的评价生物学因素及治疗相关因素对多发性骨髓瘤（MM）患者的预后价值。方法生存分析采用Kaplan—Meier方法，各组之间生存的比较采用fog—rank检验；COX回归分析用于评估独立预后因素。结果①单因素分析显示：骨髓活检以原始幼稚浆细胞增生为主、C反应蛋白（CRP）〉8．0mg／L、瘤细胞表达CD117、血清β2-微球蛋白（β2-MG）3．5—5．5mg／L、染色体克隆性异常、13号染色体异常（A13）、亚二倍体、化疗无效以及IFN应用不足6个月与较短的总体生存（OS）时间相关（P值均〈0．05）；骨髓活检以原始幼稚浆细胞增生为主、初诊时有溶骨性损害、血清β2-MG3．5～5．5mg／L、存在染色体克隆性异常、A13、亚二倍体、化疗无效、应用IFN不足6个月与较短的疾病进展时间（TTP）相关（P值均〈0．05）。②多因素分析显示IFN应用超过6个月有助于延长患者OS时间及TTP；而骨髓活检显示以原始幼稚浆细胞增生为主为TTP的独立不良预后因素。结论骨髓瘤细胞形态特征有助于评估MM患者的预后，而IFN应用超过6个月有助于延长患者的OS时间与TTP。

关键词：多发性骨髓瘤预后总体生存时间疾病进展时间

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pig7基因在急性白血病细胞中的表达及其临床意义

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中华血液学杂志 2007年第8期28卷 532-536页

作者：王东海王洋王敏刘航徐智芳饶青孟继虹王建祥中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020

目的检测 pig7基因在急性白血病(AL)细胞中的表达水平及其临床意义,在基因甲基化调控方而探讨 pig7基因表达异常的可能机制。方法应用实时定量逆转录 PCR(RT-PCR)方法对138例 AL 患者、21名正常人骨髓标本以及6个白血病细胞株进行了 pig... 详细信息

目的检测 pig7基因在急性白血病(AL)细胞中的表达水平及其临床意义,在基因甲基化调控方而探讨 pig7基因表达异常的可能机制。方法应用实时定量逆转录 PCR(RT-PCR)方法对138例 AL 患者、21名正常人骨髓标本以及6个白血病细胞株进行了 pig7转录本的检测,并在全反式维甲酸(ATRA)作用下观察 NB4细胞分化效应及 pig7基因表达情况。进行限制性内切酶分析以鉴定白血病细胞中存在的 pig7转录剪接体。通过甲基化特异性 PCR(MSP)检测白血病细胞 pig7基因启动子区域是否存在过度甲基化。结果 AL 进展期(包括初治、复发/难治)患者骨髓细胞 pig7 mRNA 相对表达水平与正常骨髓细胞相比明显降低(RQ 中位数分别为0.62和18.30,P<0.01),其中急性髓系白血病(AML)与急性淋巴细胞白血病(ALL)差异无统计学意义,而初治组与复发/难治组比较 pig7mRNA 水平差异有统计学意义,前者明显高于后者(RQ 中位数分别为1.43和0.16,P<0.05)。pig7低表达患者完全缓解率也较低(P<0.05)。NB4细胞经 ATRA 诱导分化后 pig7表达水平由1.61±0.72增至44.75±3.93(P<0.01)。酶切结果提示白血病细胞中仅存在 SIMPLE 剪接体。在 K562、HL-60及 Nalm-6细胞 pig7启动子区域存在过度甲基化,而 U937、NB4和 kasumi-1细胞中该区域非甲基化状态占优势。结论 pig7基因在 AL 的表达下调为白血病发病机制的探讨和疗效预测提供了新的思路。

关键词：白血病,急性基因,pig7 聚合酶链反应,实时定量 DNA甲基化

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Gleevec耐药白血病细胞中P-糖蛋白功能失调及其调节

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中国肿瘤临床 2007年第17期34卷 973-977页

作者：齐静杨铭周圆王彩云熊冬生杨纯正中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津市300020

目的:明确Pgp在Gleevec耐药白血病细胞中的表达和功能,为临床合理用药提供理论指导。方法:四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测K562/G01细胞对阿霉素(Doxorubicin,DOX)和伊马替尼(Gleevec,STI571)细胞毒作用的敏感性以及Pgp抑制剂维拉帕米(Verapa... 详细信息

目的:明确Pgp在Gleevec耐药白血病细胞中的表达和功能,为临床合理用药提供理论指导。方法:四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测K562/G01细胞对阿霉素(Doxorubicin,DOX)和伊马替尼(Gleevec,STI571)细胞毒作用的敏感性以及Pgp抑制剂维拉帕米(Verapamil,VPL)对K562/G01细胞药物敏感性的调节作用;RT-PCR和Western-blotting方法检测细胞中MDR基因mdr1及Pgp的表达;流式细胞仪(Flow cytometry,FCM)检测细胞内DOX及罗丹明123(Rhodamin123,Rho123)水平以及Gleevec和ATP对Pgp功能的调节作用。结果:人白血病Gleevec耐药K562/G01细胞对Gleevec耐药约40倍,但对MDR类化疗药物DOX却保持敏感,而且,Pgp抑制剂VPL不改变K562/G01细胞对DOX的敏感性。与MDR表型的K562/A02细胞一样,K562/G01细胞表达mdr1及其编码的Pgp蛋白,但Pgp却没有药物外排泵功能,K562/G01细胞中DOX或Rh123浓度与敏感细胞K562相当。加入Gleevec或ATP可明显降低K562/G01细胞中DOX水平。结论:人白血病Gleevec耐药细胞K562/G01表达mdr1/Pgp,但Pgp功能明显受阻,Bcr/Abl抑制剂Gleevec或ATP可部分恢复K562/G01细胞中Pgp的药物外排泵功能。

关键词：白血病 Gleevec耐药性 P-糖蛋白

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β-catenin基因在白血病患者中的表达及其临床意义

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中华血液学杂志 2007年第8期28卷 541-544页

作者：麦玉洁邱录贵李增军于珍李长虹王亚非王国蓉李茜中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室大连大学附属中山医院血液科 116001

目的检测β-catenin在白血病患者中的表达,仞步探讨其在白血病中的作用。方法采用半定量 RT-PCR 方法检测β-catenin 在白血病患者中的表达,同时对部分标本应用免疫细胞化学检测其蛋白表达水平,结合临床资料分析其表达的意义。结果骨髓... 详细信息

目的检测β-catenin在白血病患者中的表达,仞步探讨其在白血病中的作用。方法采用半定量 RT-PCR 方法检测β-catenin 在白血病患者中的表达,同时对部分标本应用免疫细胞化学检测其蛋白表达水平,结合临床资料分析其表达的意义。结果骨髓单个核细胞(MNC)中β-cateninmRNA 在急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中的表达(中位值分别为0.7593、0.6415)均明显高于正常人(0.3597)(P 值分别为0.001、0.016),也明显高于慢性粒细胞白血病(CML)慢性期患者(0.2571)(P 值分别为0.001、0.008),但存 AML 和 ALL 之间差异无统计学意义(P>0.05)。β-catenin 在 CML 慢性期患者的表达与正常人相比差异无统计学意义,但是在急变和加速期患者(0.9152)中明显增高,与急性白血病水平相当。按照 FAB 分型,β-catenin 在 AML M_5亚型中高表达,而在 M_3中表达明显低于其他亚型。免疫细胞化学结果显示,正常 MNC β-catenin 主要分布于细胞膜和细胞质,而在白血病细胞中,除 M_3外几乎均可以在细胞核中检测到其程度不一的表达。患者年龄、白细胞计数、高危核型以及治疗反应与β-catenin 均无显著相关,但在 AML 组β-catenin 与 CD34抗原表达有明显相关性。结论经典的 Wnt/β-catenin 信号传导途径有可能在急性白血病及 CML 急变和加速期中被激活。

关键词：基因,β-catenin 白血病基因表达

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100例多发性骨髓瘤患者细胞遗传学分析

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中华医学杂志 2007年第24期87卷 1685-1688页

作者：邓书会徐燕王亚非麦玉洁刘旭平赵耀中邹德慧王迎邱录贵中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020 大连大学附属中山医院血液科

目的总结我国多发性骨髓瘤(MM)患者的细胞遗传学特点及其临床意义。方法回顾性分析我院100例 MM 患者的细胞遗传学结果。结果 (1)患者总体的克隆性染色体畸变(CA)检出率为17.2%;纳入亚克隆后 CA 检出率为37.0%;其中亚二倍体最多见;13号... 详细信息

目的总结我国多发性骨髓瘤(MM)患者的细胞遗传学特点及其临床意义。方法回顾性分析我院100例 MM 患者的细胞遗传学结果。结果 (1)患者总体的克隆性染色体畸变(CA)检出率为17.2%;纳入亚克隆后 CA 检出率为37.0%;其中亚二倍体最多见;13号染色体异常(C13A)检出率为6.0%,其荧光原位杂交(FISH)检出率为33.3%;14号染色体易位和/或14q32异常检出率6.0%;(2)单因素分析示克隆性 CA、非超二倍体和 C13A 都使患者的总体生存时间(OS)和疾病进展时间(TTP)显著缩短;多因素分析中仅 C13A 具有独立预后意义。结论 C13A、非超二倍体、超二倍体、免疫球蛋白重链(IgH)易位等 CA 在我国 MM 患者中具有重现性。预后分析显示 C13A是独立预后不良因素。

关键词：多发性骨髓瘤细胞遗传学染色体畸变回顺性分析

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小鼠β-防御素2肿瘤疫苗的构建及特性鉴定

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中国免疫学杂志 2007年第8期23卷 675-679页

作者：马小彤徐玢董成亚石洋林永敏吴克复中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020

目的:构建分泌性小鼠β-防御素2(MBD2)真核表达质粒,转染L1210淋巴细胞白血病细胞,对转染细胞进行功能及特性鉴定。方法:RT-PCR法从小鼠皮肤细胞克隆MBD2成熟部分基因片段,用overlap PCR法将小鼠Igκ信号肽与MBD2成熟片段相连,构建MBD2... 详细信息

目的:构建分泌性小鼠β-防御素2(MBD2)真核表达质粒,转染L1210淋巴细胞白血病细胞,对转染细胞进行功能及特性鉴定。方法:RT-PCR法从小鼠皮肤细胞克隆MBD2成熟部分基因片段,用overlap PCR法将小鼠Igκ信号肽与MBD2成熟片段相连,构建MBD2分泌表达载体。经测序证实序列正确后,脂质体法转染L1210细胞,筛选稳定表达细胞株。RT-PCR、Western blot检测瘤苗MBD2的表达。Transwell法检测瘤苗分泌的MBD2对不成熟树突状细胞(iDC)迁移的作用。细胞计数、PI染色及FACS观察转染MBD2对肿瘤细胞增殖、细胞周期及MHCⅠ类(H-2Kd,H-2Dd)、Ⅱ类(I-Ad)分子及共刺激分子(CD80、CD860)表达的影响。结果:转染MBD2基因的肿瘤细胞表达并分泌MBD2,并以剂量依赖方式趋化iDC,表明具有生物学活性。转染MBD2基因对肿瘤细胞生长增殖、细胞周期及细胞表面MHC分子及共刺激分子表达无明显影响。结论:本实验成功构建了MBD2白血病细胞疫苗,为进一步体内评价抗白血病效果奠定了基础。

关键词：防御素天然免疫瘤苗急性淋巴细胞白血病

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肿瘤细胞内pH值改变与肿瘤多药耐药的关系

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中国药理学通报 2007年第9期23卷 1128-1130页

作者：芦颖李庆华庞天翔中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院.实验血液学国家重点实验室天津300020

细胞内pH值(pHi)增高是许多耐药肿瘤的共同特点,其结果引起肿瘤细胞对化疗药物的敏感性下降,降低药物疗效。通过对pHi的调节,可纠正细胞内碱化,逆转肿瘤耐药。Na+-H+交换蛋白(Na+/H+exchanger,NHE)抑制剂可通过抑制NHE的活性调节pHi,为... 详细信息

细胞内pH值(pHi)增高是许多耐药肿瘤的共同特点,其结果引起肿瘤细胞对化疗药物的敏感性下降,降低药物疗效。通过对pHi的调节,可纠正细胞内碱化,逆转肿瘤耐药。Na+-H+交换蛋白(Na+/H+exchanger,NHE)抑制剂可通过抑制NHE的活性调节pHi,为肿瘤的治疗提供了新的思路和手段。

关键词：细胞内pH值多药耐药 P-糖蛋白 Na^+-H^+交换蛋白

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