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CRISPR/Cas9-sgRNA全基因组文库筛选人单核细胞白血病功能性促癌/抑癌基因体系的建立与优化

中国科学：生命科学 2016年第7期46卷 839-850页

作者：陈晨郝莎白杨张健萍张孝兵程涛中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所实验血液学国家重点实验室天津300020 中国医学科学院干细胞医学中心天津300020 北京协和医学院干细胞与再生医学系天津300020 Department of Medicine Loma Linda University 肿瘤医学协同创新中心天津300020

CRISPR/Cas9-sg RNA(single guide RNA)全基因组文库筛选技术是在哺乳动物中进行系统基因组分析的有力工具.本文通过在人急性单核白血病细胞系THP1上优化CRISPR/Cas9-sg RNA人类全基因组慢病毒文库感染体系,构建裸鼠皮下移植肿瘤模型,... 详细信息

CRISPR/Cas9-sg RNA(single guide RNA)全基因组文库筛选技术是在哺乳动物中进行系统基因组分析的有力工具.本文通过在人急性单核白血病细胞系THP1上优化CRISPR/Cas9-sg RNA人类全基因组慢病毒文库感染体系,构建裸鼠皮下移植肿瘤模型,并通过优化测序建库方法,对肿瘤组织进行二代测序以及利用生物信息学分析获得筛选结果.裸鼠肿瘤模型表明,感染sg RNA文库后的THP1细胞成瘤能力下降,推测可能与某些促癌基因的敲除有关;通过对二代测序数据进行生物信息学分析得到了一些候选基因.实验结果表明,在人单核细胞白血病细胞系上进行CRISPR/Cas9-sg RNA全基因组文库筛选是可行的,这项工作为在其他白血病细胞系或原代细胞上的筛选应用奠定了一定基础.

关键词： CRISPR/Cas9 sgRNA THP1 基因筛选二代测序

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scFvCD20:sTRAIL蛋白诱导BJAB细胞凋亡的实验研究

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现代免疫学 2016年第3期36卷 183-188页

作者：杨雨琪张晓龙张砚君吕军强孙睿声安鹏姣于楠楠天津医科大学药学院基础医学院天津300070 中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液研究所实验血液学国家重点实验室天津300020

研究融合蛋白scFvCD20:sTRAIL诱导B淋巴瘤细胞BJAB凋亡的发生以及凋亡相关蛋白的表达变化。采用PCR、重叠PCR、酶切、连接等方法构建***20:sTRAIL、***-sTRAIL、***20及***慢病毒表达载体,瞬时转染293T细胞获得含有scFvCD20:sTRAIL融合... 详细信息

研究融合蛋白scFvCD20:sTRAIL诱导B淋巴瘤细胞BJAB凋亡的发生以及凋亡相关蛋白的表达变化。采用PCR、重叠PCR、酶切、连接等方法构建***20:sTRAIL、***-sTRAIL、***20及***慢病毒表达载体,瞬时转染293T细胞获得含有scFvCD20:sTRAIL融合蛋白的细胞培养上清,采用CCK8细胞增殖抑制实验检测scFvCD20:sTRAIL融合蛋白对CD20阳性BJAB细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测其对BJAB细胞诱导凋亡,Western blotting检测凋亡过程中内源性及外源性凋亡信号传导途径相关蛋白的变化。结果显示,成功构建了慢病毒表达载体***20:sTRAIL、***-sTRAIL、***20及***,瞬时转染293T细胞后并可获得融合蛋白的表达。与ISZ-sTRAIL比较,融合蛋白scFvCD20:sTRAIL可不同程度地提高对CD20阳性BJAB细胞的生长抑制作用,凋亡细胞增多,其中Bcl-2表达下降、Bax表达升高,Caspase 8、Caspase 9、Caspase 3及PARP被特异性剪切活化。研究表明,融合蛋白scFvCD20:sTRAIL可诱导BJAB细胞凋亡,与bcl-2/bax的表达变化以及Caspase的剪切活化有关。

关键词： CD20 TRAIL B淋巴细胞凋亡蛋白表达

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造血干细胞发生、动员、扩增及内外调控机制研究的新进展

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中国基础科学 2016年第3期18卷 7-12,41,F0003,F0004页

作者：董芳郝莎高瀛岱程涛中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所实验血液学国家重点实验室天津300020

造血干细胞(HSC)是发现最早、在临床中广泛应用并一直起着范式作用的一类重要的成体组织干细胞。HSC研究被认为是整个干细胞生物学和再生医学的主要奠基学科之一。"十二五"期间国家重大科学研究计划(973计划)在干细胞领域设立... 详细信息

造血干细胞(HSC)是发现最早、在临床中广泛应用并一直起着范式作用的一类重要的成体组织干细胞。HSC研究被认为是整个干细胞生物学和再生医学的主要奠基学科之一。"十二五"期间国家重大科学研究计划(973计划)在干细胞领域设立了"HSC维持、衰老与再生的调控机制"的项目。项目组在过去的5年时间里建立了小鼠及人HSC研究的重要平台,并借此开展了有效的合作研究,取得了一系列创新性成果。本文围绕项目组的主要研究内容,从领域的研究背景、重要工作进展及其研究意义等进行简要综述。希望有助于学界和公众更好地理解HSC正常生物学功能及其在疾病中的重要作用。

关键词：造血干细胞发生动员扩增调控

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Rheb的功能及其在血液肿瘤中的作用研究进展

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医学综述 2016年第6期22卷 1102-1106页

作者：高亚男程涛袁卫平中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020

Rheb为GTP结合蛋白,可调控细胞的生长、增殖、凋亡、存活以及自噬等细胞的基本生命活动,其与结节性硬化症和某些肿瘤相关。Rheb可调控造血干祖细胞的功能,其过表达可促进淋巴瘤生成,在白血病中可检测到Rheb的过表达。法尼基转移酶抑制剂... 详细信息

Rheb为GTP结合蛋白,可调控细胞的生长、增殖、凋亡、存活以及自噬等细胞的基本生命活动,其与结节性硬化症和某些肿瘤相关。Rheb可调控造血干祖细胞的功能,其过表达可促进淋巴瘤生成,在白血病中可检测到Rheb的过表达。法尼基转移酶抑制剂是Rheb的抑制剂,可通过促进白血病细胞凋亡,抑制白血病进展。此外,法尼基转移酶抑制剂已在血液恶性疾病中进行了Ⅱ/Ⅲ期临床试验,有可能作为药物用于临床。

关键词： Rheb 白血病淋巴瘤正常造血

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微进化与人类疾病

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医学研究杂志 2016年第12期45卷 1-5页

作者：吴克复马小彤郑国光宋玉华中国医学科学院/北京协和医学院血液病医院(血液学研究所)实验血液学国家重点实验室天津300020

生物进化的研究经历了漫长而曲折的历程，至今还在探索中。许多研究者从各自熟悉的生物学领域提出生物进化的假设，尤如瞎子摸象，分别反映了事物真相的一个方面。达尔文的物种起源阐明了生物的宏观进化历程（macroevolution，以下简称... 详细信息

生物进化的研究经历了漫长而曲折的历程，至今还在探索中。许多研究者从各自熟悉的生物学领域提出生物进化的假设，尤如瞎子摸象，分别反映了事物真相的一个方面。达尔文的物种起源阐明了生物的宏观进化历程（macroevolution，以下简称宏进化）是树干式的分枝进化（divergent evolution）.

关键词：生物进化人类疾病物种起源生物学达尔文

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构建稳定过表达转录辅助因子LBH的人间充质干细胞株

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生物技术通讯 2016年第1期27卷 40-43页

作者：牛琳段永娟王文天杨洋赵慧娟胡晓中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020

目的:构建转录辅助因子LBH(limb-bud and heart)过表达的人间充质干细胞(MSC)株,研究Lbh基因对人MSC功能的调控。方法:通过分子克隆的方法构建人Lbh基因的慢病毒表达质粒p CDHP-Lbh,经限制性内切酶酶切和核酸测序鉴定,利用293T细胞包装... 详细信息

目的:构建转录辅助因子LBH(limb-bud and heart)过表达的人间充质干细胞(MSC)株,研究Lbh基因对人MSC功能的调控。方法:通过分子克隆的方法构建人Lbh基因的慢病毒表达质粒p CDHP-Lbh,经限制性内切酶酶切和核酸测序鉴定,利用293T细胞包装表达Lbh基因的慢病毒及对照;将包装的病毒感染人MSC,利用表达载体携带的GFP报告基因,采用流式细胞术分选GFP阳性目的细胞;通过油红O染色鉴定阳性细胞的成脂分化能力,通过茜素红和硝酸银染色鉴定阳性细胞的成骨分化能力。结果:双酶切和测序结果表明正确克隆了人Lbh基因的全长CDS序列,定量PCR和Western印迹结果表明构建的p CDHP-Lbh重组质粒能够表达Lbh基因;流式分选获得LBH稳定表达的人MSC细胞株,该细胞株经成骨和成脂诱导分化培养后,油红O染色、茜素红染色和硝酸银染色结果均呈阳性。结论:构建了人Lbh基因的慢病毒表达质粒p CDHP-Lbh,并获得稳定表达Lbh基因的人MSC细胞株,该细胞株保留了向脂肪细胞和成骨细胞定向分化的能力。本研究为进一步探讨Lbh基因对人MSC功能的调控提供了重要的实验基础。

关键词： limb-bud and heart 转录辅助因子人间充质干细胞慢病毒载体

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白血病中的Allee效应

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白血病．淋巴瘤 2016年第4期25卷 199-202页

作者：吴克复郑国光马小彤宋玉华中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020

Allee效应是生态学表述种群大小或密度与生存繁衍关系的个体适度性状，与医学生物学中群体生存的浓度或密度依赖概念一致。近年来理论生物学对Allee效应进行了系统的分析研究，并应用于肿瘤生物学研究。白血病细胞以机体为生存环境，表... 详细信息

Allee效应是生态学表述种群大小或密度与生存繁衍关系的个体适度性状，与医学生物学中群体生存的浓度或密度依赖概念一致。近年来理论生物学对Allee效应进行了系统的分析研究，并应用于肿瘤生物学研究。白血病细胞以机体为生存环境，表现出显著的Allee效应。作者根据多年实验工作和文献资料对白血病细胞的浓度依赖性与Allee效应进行比较，发现二者并无原则性的区别。文章用生态学的观点初步探讨了体外培养细胞的Allee效应，白血病尤其是微小残留白血病的Allee效应，以及Allee效应与白血病发病机制和复发动力学的关系，并展望了今后的发展方向。

关键词：白血病微小残留病 Allee效应进化医学

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利用CRISPR/Cas9技术建立诱导性敲除MEIS1基因的HEK293T细胞株

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中国细胞生物学学报 2016年第8期38卷 978-985页

作者：张明智王梦鸽王洪涛苏培刘鑫张磊升刘翠翠王钰吴丹周家喜彭莎西北农林科技大学动物医学院陕西省干细胞工程技术研究中心陕西省农业分子生物学重点实验室杨凌712100 中国医学科学院北京协和医学院血液病医院(血液学研究所)实验血液学国家重点实验室天津300020

CRISPR/Cas9是新一代基因组编辑技术,可简便快捷地在哺乳动物细胞对基因进行敲除、敲入。但常规的CRISPR/Cas9表达系统直接转染效果差、病毒包装效率低,极大地限制了CRISPR/Cas9系统的广泛使用。该研究应用Tet-on系统,建立了Dox诱导Cas... 详细信息

CRISPR/Cas9是新一代基因组编辑技术,可简便快捷地在哺乳动物细胞对基因进行敲除、敲入。但常规的CRISPR/Cas9表达系统直接转染效果差、病毒包装效率低,极大地限制了CRISPR/Cas9系统的广泛使用。该研究应用Tet-on系统,建立了Dox诱导Cas9表达的293T细胞株,命名为293T-i Cas9。MEIS1(myeloid ectropic viral integration site 1)是TALE(three amino acid loop extension)同源域家族的转录因子,其在白血病发生发展、胚胎造血系统发育及神经系统发育中有重要作用,但其作用机制仍未完全明确。将靶向MEIS1 Exon3的sg MEIS1表达载体转入293T-iCas9,SURVEYOR实验和Western blot检测结果表明,sg MEIS1有效地指导Cas9进行基因组编辑。最终经测序和Western blot结果证明,成功建立了MEIS1敲除细胞株,这为研究MEIS1的功能提供了重要的工具。

关键词： MEIS1 CRISPR/Cas9 iCas9 基因敲除 HEK293T细胞

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中国骨髓增生异常综合征患者目前诊断治疗模式调查分析

中国骨髓增生异常综合征患者目前诊断治疗模式调查分析

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中华医学会第14次全国血液学学术会议

作者：李羿秦铁军徐泽锋张悦方力纬张宏丽潘丽娟胡耐博曲士强李冰肖志坚中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院

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低剂量5-Fu与Ad-IL24联用对肝癌细胞HepG2生长的抑制作用及其机制

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肿瘤防治研究 2016年第12期43卷 1030-1034页

作者：杨圆圆卢杨张晓龙张晴李真真张砚君中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所实验血液学国家重点实验室天津300020 西安交通大学第二附属医院生物诊断与生物治疗国家地方联合工程研究中心西安710004

目的探讨低剂量5-Fu与腺病毒表达的IL24联用对HepG2细胞的生长抑制作用及其机制。方法采用PCR、酶切、连接等方法构建pAd-IL24腺病毒表达载体,Western blot检测IL24蛋白水平表达情况。CCK8法确定5-Fu联用剂量,检测与Ad-IL24联用对HepG2... 详细信息

目的探讨低剂量5-Fu与腺病毒表达的IL24联用对HepG2细胞的生长抑制作用及其机制。方法采用PCR、酶切、连接等方法构建pAd-IL24腺病毒表达载体,Western blot检测IL24蛋白水平表达情况。CCK8法确定5-Fu联用剂量,检测与Ad-IL24联用对HepG2肝癌细胞的抑制效果,并计算联合指数。流式细胞术检测不同腺病毒感染复数及不同5-Fu浓度下绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性细胞的比例。流式细胞术检测5-Fu作用前后HepG2细胞表面柯萨奇腺病毒受体(coxsackie adenovirus receptor,CAR)的表达变化。结果成功构建腺病毒表达载体pAd-IL24。确定5-Fu联用剂量为1μg/ml和2μg/ml,Ad-IL24与低剂量5-Fu联用可以协同抑制HepG2肝癌细胞生长,联合指数分别为0.75和0.64。低剂量5-Fu作用于HepG2后使其表面CAR水平显著增加(P<0.01)。结论低剂量5-Fu与Ad-IL24联用对HepG2肝癌细胞系的抑制有协同作用,可能与5-Fu上调HepG2表面CAR水平相关。

关键词：肝癌 5氟尿嘧啶 IL24 腺病毒柯萨奇腺病毒受体

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