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第十六届中国西部实验动物管理与学术研讨会

作者：苗雨润宋庆凯陈玲霞尹博文李晓飞代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室树鼩种子资源中心昆明650118

目的建立树鼩角膜内皮细胞(corneal endothelial cells,CECs)体外分离、培养及纯化的稳定技术,为人类眼科角膜疾病提供新的实验材料.方法通过比较揭膜法、双酶消化法及揭膜-消化两步法,确定每种树鼩原代CECs取材方法的优劣性.分别使用... 详细信息

目的建立树鼩角膜内皮细胞(corneal endothelial cells,CECs)体外分离、培养及纯化的稳定技术,为人类眼科角膜疾病提供新的实验材料.方法通过比较揭膜法、双酶消化法及揭膜-消化两步法,确定每种树鼩原代CECs取材方法的优劣性.分别使用DMEM/F12,M199,Ham's F12/M199三种培养液以确定树鼩CECs原代细胞最适培养液.使用TGF-β抑制剂、低血清培养法及梯度消化法来探讨树鼩 CECs纯化的可行性.苏木精-伊红染色观察细胞形态,根据树鼩神经元烯醇化酶(NES)设计并筛选特异性引物,使用PCR方法检测细胞NES表达情况并用NES抗体进行细胞免疫荧光染色鉴定.结果揭膜法可以快速、有效得到高纯度的树鼩 CECs细胞.Ham's F12/M199培养液是树鼩CECs的最适培养液.使用TGF-β抑制剂可以达到CECs的纯化目的.结论优化的树鼩CECs细胞培养纯化方法对树鼩CECs的体外培养更适宜,优化条件下分离培养的细胞符合CECs的一般特征.

关键词：树鼩角膜内皮细胞体外原代培养优化

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体外诱导树鼩骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

体外诱导树鼩骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

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第十六届中国西部实验动物管理与学术研讨会

作者：苗雨润李娜匡德宣宋庆凯袁圆王璇张志成陆彩霞中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室树鼩种子资源中心昆明650118

目的探讨树鼩骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)向神经元样细胞分化的可行性。方法通过采用不同诱导物浓度的神经元样细胞诱导液对体外培养的树鼩BM-MSCs向神经元样细胞进行诱导分化,用PCR方法检测细胞神经元烯醇化酶(neuron specific enolas... 详细信息

目的探讨树鼩骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)向神经元样细胞分化的可行性。方法通过采用不同诱导物浓度的神经元样细胞诱导液对体外培养的树鼩BM-MSCs向神经元样细胞进行诱导分化,用PCR方法检测细胞神经元烯醇化酶(neuron specific enolase,NES)和α-突触核蛋白(α-SYN)表达情况,并用NES抗体进行细胞免疫荧光染色鉴定。结果使用浓度为10ng/mL表皮生长因子(EGF)和20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导液在体外诱导培养树鼩BM-MSCs至12 d时可以得到良好的诱导结果。结论优化的双细胞因子诱导培养液可以成功将树鼩BM-MSCs诱导分化为神经元样细胞,分化的细胞符合神经元样细胞的一般特征。

关键词：树鼩间充质干细胞体外诱导培养神经元样细胞

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腹泻树鼩肠道阿米巴原虫携带情况调查

腹泻树鼩肠道阿米巴原虫携带情况调查

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第十六届中国西部实验动物管理与学术研讨会

作者：宋庆凯苗雨润尹博文陈玲霞代解杰孙晓梅中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的调查腹泻树鼩肠道中阿米巴原虫携带情况，查找可能导致树鼩腹泻的寄生虫类病原，为实验树鼩的寄生虫质量控制提供依据.方法采集78只腹泻树鼩新鲜粪便和全血，分离血清，其中野生来源样本45份，人工繁育样本33份.分别采用生理盐水... 详细信息

目的调查腹泻树鼩肠道中阿米巴原虫携带情况，查找可能导致树鼩腹泻的寄生虫类病原，为实验树鼩的寄生虫质量控制提供依据.方法采集78只腹泻树鼩新鲜粪便和全血，分离血清，其中野生来源样本45份，人工繁育样本33份.分别采用生理盐水涂片法、碘液染色法进行阿米巴原虫形态学检测，采用ELISA方法进行粪便中阿米巴抗原和血清中IgG抗体检测.结果形态学镜检结果显示，野生来源和人工繁育腹泻树鼩肠道中阿米巴原虫携带率分别为42.22％(19/45)、33.33％(11/33);经ELISA检测粪便中阿米巴抗原，阿米巴原虫携带率分别为64.44％(29/45)、42.42％(14/33).采用ELISA粪便抗原检出率高于形态学镜检法.经ELISA检测血清IgG抗体阳性率分别为66.67％(30/45)、63.63％(21/33).结论腹泻树鼩对阿米巴原虫的携带率较高，该原虫可能是导致树鼩腹泻的病原之一.日常饲养过程中应加强阿米巴病的监测和防治，防止肠道寄生虫病的传播.

关键词：树鼩阿米巴原虫形态学检测 ELISA检测

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驯养繁殖树鼩主要消化腺的组织学观察

驯养繁殖树鼩主要消化腺的组织学观察

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第十六届中国西部实验动物管理与学术研讨会

作者：匡德宣王文广孙晓梅黄晓云陆彩霞罕园园仝品芬代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的了解树鼩主要消化腺的组织学结构特征，建立树鼩正常的消化腺组织学图谱。方法采用常规组织处理、制片、HE染色及显微镜技术对人工驯养繁殖仔一代树鼩腮腺、颌下腺、舌下腺、胰腺和肝脏进行了组织学观察。结果 (1)腮腺为纯浆液性... 详细信息

目的了解树鼩主要消化腺的组织学结构特征，建立树鼩正常的消化腺组织学图谱。方法采用常规组织处理、制片、HE染色及显微镜技术对人工驯养繁殖仔一代树鼩腮腺、颌下腺、舌下腺、胰腺和肝脏进行了组织学观察。结果 (1)腮腺为纯浆液性腺泡，闰管明显，管壁由单层低立方形上皮细胞组成，官腔充满分泌物。(2)颌下腺为混合性腺体，以浆液性腺泡为主，分泌管较长。(3)舌下腺是以黏液性腺泡为主的混合腺，含有少量闰管。(4)肝脏表面为一薄层致密结缔组织被膜，肝实质为多个分界不明显的肝小叶，肝小叶中央为中央静脉。肝细胞呈多边形，核大而圆，位于细胞中央，多数为单核，少数为双核，细胞质呈红色，胞质内有空泡和小腔隙。汇管区小叶间动脉、小叶间静脉及小叶间胆管结构较为明显。(5)胰腺表面为一层疏松结缔组织被膜，胰腺实质由外分泌部和内分泌部组成。外分泌部包含腺泡和导管，腺泡由浆液性腺细胞组成，导管由闰管、小叶内导管、小叶间导管、叶间导管和胰管组成。内分泌部又称为胰岛，是一些大小不等的细胞团和细胞索，不规则地散布于外分泌部的腺泡之间，胞质染色较外分泌部浅。结论树鼩消化腺在组织形态学上接近于灵长类动物，可以为研究树鼩消化腺的功能和病变，以及建立人类相关疾病的动物模型提供组织学依据。

关键词：树鼩驯养繁殖腮腺颌下腺舌下腺肝脏胰腺组织学

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新生树鼩心肌细胞与心肌成纤维细胞的分离培养、纯化及鉴定

新生树鼩心肌细胞与心肌成纤维细胞的分离培养、纯化及鉴定

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第十六届中国西部实验动物管理与学术研讨会

作者：苗雨润宋庆凯匡德宣陈玲霞尹博文李晓飞代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室树鼩种质资源中心昆明650118

目的为了分离得到可以应用于树鼩建立人类心血管病理、毒理细胞模型的纯度较高、活力较强的心肌细胞和心肌成纤维细胞.方法使用差速贴壁1.5 h纯化心肌细胞进行培养,并比较5-溴-2-脱氧尿苷、阿糖胞苷及TGF-β抑制剂的纯化效率以获取最... 详细信息

目的为了分离得到可以应用于树鼩建立人类心血管病理、毒理细胞模型的纯度较高、活力较强的心肌细胞和心肌成纤维细胞.方法使用差速贴壁1.5 h纯化心肌细胞进行培养,并比较5-溴-2-脱氧尿苷、阿糖胞苷及TGF-β抑制剂的纯化效率以获取最适纯化方案,培养过程在37℃、5％CO2条件下进行.使用MTT法测定细胞活力以确定方法可行性.利用α-横纹肌肌钙蛋白(α-SA)及心肌肌钙蛋白Ⅰ(TnⅠ)对树鼩心肌细胞进行免疫组化及免疫荧光鉴定,利用波性蛋白(Vimentin)对树鼩心肌成纤维细胞进行免疫荧光染色以达到鉴定目的.结果原代培养新生树鼩心肌细胞生长良好.在倒置显微镜下观察,培养10d左右的心肌细胞可以基本完成局部融合并有伴细胞搏动.MTT法检测结果显示心肌细胞活力可以在最少15d内保持良好水平.细胞鉴定结果显示树鼩心肌细胞α-SA免疫组化呈阳性,Tn Ⅰ免疫荧光鉴定呈阳性,心肌成纤维细胞呈阴性,符合一般心肌细胞特征;心肌成纤维Vimentin免疫荧光结果呈阳性.结论分离纯化得到的树鼩心肌细胞和心肌成纤维细胞,细胞纯度较高、结构完整并具有相对较高的细胞活力,是一种较为理想的、可以应用于树鼩建立人类心血管病理、毒理细胞模型的心肌细胞和心肌成纤维细胞.

关键词：树鼩原代培养心肌细胞心肌成纤维细胞鉴定

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BALB/c小鼠作为单纯疱疹病毒1型感染模型的免疫学分析

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微生物与感染 2017年第4期12卷 222-228页

作者：张小龙汤贝贝何玉凤段永忠王丽春张志晓周巨民李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 中国科学院/云南省动物模型与人类疾病机理重点实验室中国科学院昆明动物研究所昆明650223

在单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)小鼠感染及其相关研究中,临床病理和免疫学指标对其分析具有重要技术意义。本研究观察了HSV-1在不同条件下感染BALB/c小鼠后的多个免疫学指标,包括外周血单核细胞(peripheral bloo... 详细信息

在单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)小鼠感染及其相关研究中,临床病理和免疫学指标对其分析具有重要技术意义。本研究观察了HSV-1在不同条件下感染BALB/c小鼠后的多个免疫学指标,包括外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)群体中树突细胞比例及功能、血清中和抗体水平、PBMC中HSV-1抗原特异性T细胞水平,以及潜伏感染期小鼠神经组织中CD8^+T细胞浸润情况。结果显示,HSV-1毒株Mckrae、17^+以角膜及滴鼻途径感染3周龄及6周龄BALB/c小鼠后,小鼠PBMC中树突细胞数量增加,并显示出刺激病毒抗原特异性T细胞增殖的能力。病毒感染后35d,小鼠PBMC中未检测到白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)^+抗原特异性T细胞,但能检测到低水平的γ干扰素(interferonγ,IFN-γ)^+抗原特异性T细胞;小鼠血清中未检测到或仅能检测到低水平的中和抗体。HSV-1以皮下及足垫注射途径感染BALB/c小鼠90d后,足垫感染途径较皮下感染诱导出更高水平的血清中和抗体,PBMC中可检测到IL-4^+及IFN-γ^+抗原特异性T细胞,但不同毒株及小鼠周龄之间出现T细胞反应程度差异。组织病理学结果表明,各组小鼠三叉神经组织中均有CD8^+T细胞浸润。这些结果提示,不同HSV-1毒株以不同途径感染不同周龄BALB/c小鼠后,均可刺激树突细胞成熟及呈递病毒抗原,但血清中和抗体及PBMC中病毒抗原特异性T细胞水平在不同毒株、感染途径及小鼠周龄之间有差异。

关键词： BALB/c小鼠单纯疱疹病毒1型免疫学分析

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树鼩脂肪转录组SNP位点发掘及其功能注释

树鼩脂肪转录组SNP位点发掘及其功能注释

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2017年第十五届中国北方实验动物科技年会

作者：罕园园孙晓梅匡德宣陆彩霞仝品芬王文广李娜余波代解杰中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南省科学技术院

从正常笼养树鼩腹部的脂肪转录组数据开发SNP分子标记。检测了6只动物共计274278568条unigene(总长度43138417bp)序列信息后,在262980条unigene(5.75%)中发现SNP位点263071个,SNP发生频率为1/164bp,其中转换(transition)177562个,颠换(transversion)85509个。在所有变异类型中,A/G和C/T发生频率最高,分别达33.85%和33.66%。将包含SNP位点的262980条unigene通过参比序列进行注释,并对其进行GO分类、COG分类注释和代谢通路注释(KEGGpathway),结合已有研究,分别筛选到1187个有GO注释、77个有COG注释和1080条个有KEGO通路注释的脂肪转录组中的可能与脂肪形成和代谢有关的SNP标记。

关键词：树鼩转录组单核苷酸多态性功能注释

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登革病毒四型联合重组包膜蛋白Ⅲ区的表达和免疫原性鉴定

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中国生物工程杂志 2016年第1期36卷 1-6页

作者：邱丽娟赵玉娇李多黄新伟王晓丹席珏敏潘玥陈俊英孙强明北京协和医学院/中国医学科学院医学生物学研究所昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

登革热在全球范围内广泛流行,但是目前为止却仍然没有疫苗上市,疫苗的开发迫在眉睫。抗体依赖增强感染效应是登革病毒疫苗开发中遇到的一个瓶颈问题。研究表明登革病毒的包膜蛋白Ⅲ区能够介导中和抗体产生,且诱导产生较少的交叉抗体或... 详细信息

登革热在全球范围内广泛流行,但是目前为止却仍然没有疫苗上市,疫苗的开发迫在眉睫。抗体依赖增强感染效应是登革病毒疫苗开发中遇到的一个瓶颈问题。研究表明登革病毒的包膜蛋白Ⅲ区能够介导中和抗体产生,且诱导产生较少的交叉抗体或无交叉抗体,能够大大减弱抗体依赖增强感染效应,因而是登革热重组蛋白疫苗的首选靶标。通过酵母密码子优化后合成同时包含4种血清型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区的四价联合DV EDⅢ蛋白序列,随后构建酵母表达质粒,并获得酵母表达菌株,经诱导后四联DV EDⅢ蛋白获得高效表达。通过Western blot、ELISA检测及蛋白质免疫原性鉴定,结果表明登革病毒四联DV EDⅢ蛋白表达质粒构建成功,重组蛋白在毕赤酵母获得高效表达,免疫小鼠后能够介导产生较高水平的血清效价。这表明已获得了能引起有效免疫反应的四型登革病毒EDⅢ蛋白,为登革病毒疫苗的研究提供了良好的基础。

关键词：登革病毒包膜EDⅢ蛋白疫苗重组蛋白

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circRNA研究进展

circRNA研究进展

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第十六届中国西部实验动物管理与学术研讨会

作者：陆彩霞代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室实验树鼩标准化与应用研究省创新团队云南昆明650118

环形RNA(circular RNAs,circRNAs)是一类通过反向剪接所形成的闭合环状RNA分子,广泛存在于各种生物细胞中,并且具有结构稳定、表达量丰富以及在不同组织及其不同发育阶段具有表达特异性等特征.circRNAs可以作为miRNA海绵调控miRNA的表达... 详细信息

环形RNA(circular RNAs,circRNAs)是一类通过反向剪接所形成的闭合环状RNA分子,广泛存在于各种生物细胞中,并且具有结构稳定、表达量丰富以及在不同组织及其不同发育阶段具有表达特异性等特征.circRNAs可以作为miRNA海绵调控miRNA的表达,通过cis或trans调控其母基因的表达,并参与蛋白的翻译.此外,circRNA在神经发育及相关疾病的发生和发展过程中起着重要的调控作用,有望成为疾病诊断的分子标志物.本文就circRNA的分子特征、形成机制、功能、常用的数据库及其与神经系统疾病的关系做一综述.

关键词：环状RNA microRNA海绵 circRNA数据库神经系统

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肠道病毒71型体外感染树鼩肾细胞特性观察

肠道病毒71型体外感染树鼩肾细胞特性观察

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第十六届中国西部实验动物管理与学术研讨会

作者：王文广匡德宣尹博文陆彩霞罕园园李娜仝品芬孙晓梅蔡路奎代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心云南省重大传染病疫苗研发重点实验室中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队昆明650118

目的探讨肠道病毒71型(EV71)对树鼩肾细胞的感染特性。方法通过组织块贴壁法分离培养树鼩原代肾细胞,观察细胞形态并进行传代培养,利用细胞角蛋白18对树鼩肾细胞进行间接免疫荧光鉴定。用肠道病毒EV71感染树鼩肾细胞,通过倒置显微镜... 详细信息

目的探讨肠道病毒71型(EV71)对树鼩肾细胞的感染特性。方法通过组织块贴壁法分离培养树鼩原代肾细胞,观察细胞形态并进行传代培养,利用细胞角蛋白18对树鼩肾细胞进行间接免疫荧光鉴定。用肠道病毒EV71感染树鼩肾细胞,通过倒置显微镜观察细胞病变情况,结合间接免疫荧光实验观察细胞中病毒蛋白的表达情况,采用实时荧光定量PCR技术检测病毒载量,以Vero细胞为对照,研究EV71对树鼩肾细胞的感染情况。结果通过组织块贴壁法可以快速获得树鼩原代肾细胞,并可进行多次传代培养,细胞为梭形,贴壁呈铺路石状,免疫荧光鉴定为肾上皮细胞。肠道病毒EV71可以感染树鼩肾细胞,使之出现明显的细胞变圆、脱落或解体等病变,免疫荧光实验可以观察到病毒蛋白的分布,实时荧光定量PCR检测病毒载量最高可达105拷贝/mL,病变情况和增殖趋势与Vero细胞相似。结论 EV71可以体外感染树鼩肾细胞,该细胞模型可为EV71药物筛选和感染机制研究提供平台。

关键词：树鼩肾细胞肠道病毒71型(EV71)

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