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中国免疫学会第九届全国免疫学学术大会

作者：米鍇吴晋元易山孙晓琴牛香莲李鸿钧孙茂盛中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室

轮状病毒是造成5岁以下婴幼儿腹泻的主要病原体,全球每年有大约45万婴幼儿因感染轮状病毒导致严重腹泻而死亡.流行病学调查显示,全球轮状病毒流行株以G1,G2,G3,G4几种血清型为主,近几年G9型也出现流行趋势.轮状病毒作为一种多血清型的病... 详细信息

轮状病毒是造成5岁以下婴幼儿腹泻的主要病原体,全球每年有大约45万婴幼儿因感染轮状病毒导致严重腹泻而死亡.流行病学调查显示,全球轮状病毒流行株以G1,G2,G3,G4几种血清型为主,近几年G9型也出现流行趋势.轮状病毒作为一种多血清型的病毒,一度使其疫苗的研发策略在单价疫苗或多价疫苗之间存在争议.目前上市的轮状病毒疫苗有Rotarix(单价疫苗)和Rotateq(多价疫苗),虽然都具有良好的保护效果及安全性,但是这些疫苗是否具有交叉保护作用来抵抗稀有血清型轮状病毒的感染,目前尚无完整的研究资料.

关键词：轮状病毒单价疫苗多价疫苗免疫原性交叉保护

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登革病毒通过IL-10非依赖性方式抑制NOS2表达介导抗体依赖增强感染

登革病毒通过IL-10非依赖性方式抑制NOS2表达介导抗体依赖增强感染

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第九届全国免疫学学术大会

作者：黄新伟李多赵玉娇孙强明北京协和医学院/中国医学科学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室

登革热病毒(DENV)是一种蚊媒病毒,在超过100多个国家中,尤其是亚洲和拉丁美洲,引起了巨大的公共卫生问题。据估计,每年有超过5000万人感染登革热病毒。一般认为登革热病毒感染的抗体增强效应(ADE)参与登革出血热(DHF)和登革休克综合症(D... 详细信息

登革热病毒(DENV)是一种蚊媒病毒,在超过100多个国家中,尤其是亚洲和拉丁美洲,引起了巨大的公共卫生问题。据估计,每年有超过5000万人感染登革热病毒。一般认为登革热病毒感染的抗体增强效应(ADE)参与登革出血热(DHF)和登革休克综合症(DSS)等重症疾病的免疫发病机制。目前普遍认为,登革热病毒的抗体依赖增强感染是导致重或死亡的最主要原因,而对于重症登革热患者的发病机制研究尚不充分。体外THP-1细胞模型的研究提出了DENV ADE感染的假说,即DENV ADE感染时,一方面能够通过负反馈调节RIG/MDA5,抑制一型干扰素的产生,从而降低细胞内的抗病毒基因表达,如NOS2;另一方面,抗体与Fc受体的结合能够增强IL-10的表达,从而抑制IFN的进一步产生。该假说虽然被普遍接受,但是与一些体内及体外研究结果不符:例如,DENV通过直接或ADE感染单核细胞后,在IFN分泌水平上并没有变化;另外,直接或ADE感染单核细胞释放IL-10的量主要取决于宿主细胞的基因型,与感染方式不相关。这些研究结果提示,一种不依赖于IFN和IL-10作用的普遍的DENV抗体依赖增强机制的存在。本研究中,我们通过一型干扰素缺陷单核细胞株K562建立的DENV ADE模型,体现出了内部ADE增强作用,即亚中和抗体的结合不仅仅促进病毒进入细胞的过程,而且能够显著增加病毒在胞内的增殖。进一步的分析显示,ADE组和直接感染组中确实存在RIG-I和MDA5表达的差异,其随后的NF-κB和IRF-1信号分子的激活也存在显著差异,从而导致最终的抗病毒效应分子NOS2表达异同。通过对NOS2的功能抑制,我们发现K562细胞中的ADE现象主要取决于NOS2的表达调控,而NOS2的转录也恰受到RIG-I/MDA-5-NF-κB-IRF-1通路的调控。此外。通过CRISPR/CAS 9系统,成功构建了IL-10敲除细胞系,该细胞系仍能重现野生型中的ADE感染现象,证明了IL-10对于DENV ADE感染的非依赖性。因此,在K562细胞中,我们发现了一条不依赖于一型干扰素途径的登革热抗体依赖增强机制,即DENV ADE通过下调RIG-I/MDA-5—NF-κB-IRF-1信号通路,降低天然抗病毒基因NOS2的表达,从而促进病毒在胞内合成。该研究将有助于加深我们对DENV ADE感染的复杂性的认知,并为重症登革热疾病的治疗提供潜在的靶点。

关键词：登革热病毒 ADE RIG-I MDA-5 NOS2

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人工饲养母树鼩产后食仔的综合干预

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中国比较医学杂志 2014年第1期24卷 74-76,55页

作者：匡德宣孙晓梅仝品芬王文广陆彩霞代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心、云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的预防人工饲养母树鼩产后食仔。方法从人工饲养繁殖种群选出50只有产后食仔癖的母树鼩，采取多种措施综合预防产后食仔。结果50只曾有产后食仔史的树鼩怀孕45只，5只未怀孕，怀孕率为90％，其中2只怀孕10～15d流产，1只难产死亡，6... 详细信息

目的预防人工饲养母树鼩产后食仔。方法从人工饲养繁殖种群选出50只有产后食仔癖的母树鼩，采取多种措施综合预防产后食仔。结果50只曾有产后食仔史的树鼩怀孕45只，5只未怀孕，怀孕率为90％，其中2只怀孕10～15d流产，1只难产死亡，6只仍有产后食仔现象，食仔率由100％降为14％。36只母树鼩怀孕产后无食仔现象出现，并能正常将所生幼仔哺乳成活，预防成功率为86％。结论采取综合预防措施可有效控制和减少树鼩产后食仔，对提高人工驯养树鼩种群的繁殖率具有借鉴作用。

关键词：树鼩产后食仔综合干预

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树鼩骨髓间充质干细胞体外分离培养及成脂成骨诱导

树鼩骨髓间充质干细胞体外分离培养及成脂成骨诱导

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2014第十一届中国实验动物科学年会

作者：陆彩霞李晓飞王文广孙晓梅仝品芬匡德宣代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的探讨树鼩骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的体外分离、传代及定向诱导为脂肪细和成骨细胞的可行性.方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法对树鼩骨髓间充质干细胞进行体外分离、扩增、纯化，倒置相差显微镜进行形态学观察.用成脂诱导液(D... 详细信息

目的探讨树鼩骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的体外分离、传代及定向诱导为脂肪细和成骨细胞的可行性.方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法对树鼩骨髓间充质干细胞进行体外分离、扩增、纯化，倒置相差显微镜进行形态学观察.用成脂诱导液(DMEM/F12+ 10％ FBS+ 100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素+1.0μM地塞米松+0.2 mM吲哚美辛+0.01 mg/mL胰岛素+0.5 mM IBMX)和成骨诱导液(高糖DMEM+10％ FBS+ 100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素+50ng/mL BMP-2)对分离的树鼩BM-MSCs分别定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞.结果原代和传代细胞为梭形或三角形，可增殖形成克隆.BM-MSCs成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴，成骨诱导后茜素红染色可观察到矿化结节.结论密度梯度离心联合贴壁培养法分离培养树鼩BM-MSCs简便可行，获得的BM-MSCs可体外诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞.

关键词：树鼩骨髓间充质干细胞细胞培养成脂诱导成骨诱导

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HCV感染树鼩模型中腹部横切手术及肝门静脉注射新方法的建立

HCV感染树鼩模型中腹部横切手术及肝门静脉注射新方法的建立

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2014第十一届中国实验动物科学年会

作者：匡德宣殷安国孙晓梅王文广李晓飞仝品芬陆彩霞代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的采用腹部横切手术及肝门静脉注射法将HCV迅速足量注射接种到树鼩体内肝脏,提高HCV对树鼩的感染率。方法采用横切打开树鼩腹腔,找到肝门静脉,进行肝门静脉注射接种HCV,手术后1W进行采血、ALT检测、HCV病毒载量检测、肝脏病理检测及... 详细信息

目的采用腹部横切手术及肝门静脉注射法将HCV迅速足量注射接种到树鼩体内肝脏,提高HCV对树鼩的感染率。方法采用横切打开树鼩腹腔,找到肝门静脉,进行肝门静脉注射接种HCV,手术后1W进行采血、ALT检测、HCV病毒载量检测、肝脏病理检测及HCV-RNA抗原检测。结果横切手术及肝门静脉注射20只树鼩,手术后经护理恢复,树鼩伤口恢复良好,手术成功率及肝门静脉注射准确率均达100％,保证HCV完全快速进入树鼩肝脏。有60％ (12/20)树鼩出现一过性的病毒血症或间歇性病毒血症,感染树鼩的病毒载量最高可达到1x105 copies/mL,肝功能中ALT指标最高可达到192u/L,肝脏活体组织病理检查发现不同程度的肝炎症状,肝组织能检测到HCV-RNA抗原。结论腹部横切具有充分暴露肝门静脉、操作方便、符合解剖生理、组织创伤较小、伤口易于愈合等优点,适用于肝门静脉注射,同时提高了感染率,该技术方法为进一步深入研究HCV感染树鼩奠定基础,对于其它相关实验动物和动物实验具有一定借鉴经验和参考价值。

关键词：腹部横切手术肝门静脉注射 HCV树鼩模型

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树鼩实验动物化规划与动物福利的探讨

树鼩实验动物化规划与动物福利的探讨

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2014第十一届中国实验动物科学年会

作者：匡德宣江勤芳仝品芬高家红孙晓梅代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

树鼩在生物学特性、生理生化、新陈代谢和基因组等方面近似于人类，被广泛应用于生理学、病理学、病毒学、免疫学、药理学及遗传学等多个领域。迄今为止用于生物医学研究的树鼩大部分来自野生，实验树鼩尚无国家质量控制标准。为了保证... 详细信息

树鼩在生物学特性、生理生化、新陈代谢和基因组等方面近似于人类，被广泛应用于生理学、病理学、病毒学、免疫学、药理学及遗传学等多个领域。迄今为止用于生物医学研究的树鼩大部分来自野生，实验树鼩尚无国家质量控制标准。为了保证树鼩引种、驯化、饲养、繁殖、质量控制及福利的规范化和科学化，提高树鼩繁殖率和成活率。本文从兽医公共卫生及实验动物科学的角度，对野生树鼩的捕捉、运输、检疫、饲养及繁育等方面的基本原则及技术知识作一简述，为从事树鼩工作的有关人员及树鼩实验动物化研究提供参考。

关键词：树鼩实验动物化规划动物福利

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云南HPV-16型E6、E7基因的突变分析

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微生物学杂志 2014年第2期34卷 17-23页

作者：张晓琳刘峰姚月婷李亚东周竞贤易力姚宇峰俞建昆中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 武警云南省总队医院检验科云南昆明650111

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)16型(HPV-16)是引起宫颈癌的一种主要高危型病毒,其2个致癌基因E6和E7的核酸序列变异可能会影响其对宿主细胞的致癌性,已有研究表明其序列突变呈现地域差异性。因此,研究不同地域HPV-16这2个基... 详细信息

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)16型(HPV-16)是引起宫颈癌的一种主要高危型病毒,其2个致癌基因E6和E7的核酸序列变异可能会影响其对宿主细胞的致癌性,已有研究表明其序列突变呈现地域差异性。因此,研究不同地域HPV-16这2个基因的变化情况是宫颈癌流行病学调研的主要内容,也可为研究E6和E7的致癌性积累数据。研究以NCBI登录号为NC_001526.2的HPV-16型病毒的序列为参照,采用Neighbor-joining方法对云南地区74例HPV-16样本的E6、E7的DNA序列构建进化树,结果显示:只有亚洲和欧洲变异亚型,而没有发现非洲1、非洲2、亚-美洲和北美洲这4种变异亚型。DNA序列分析显示:E6的碱基突变以T178G(D25E,59.46%)和T350G(L83V,8.11%)为主,E7的碱基突变主要以A647G(N29S,59.46%)和T846C(同义突变,60.81%)为主。发现E6的新突变有A95G(同义突变,1.35%)和A135G(K11R,1.35%);E7的新突变有C625T(L22F,1.35%)、C627T(同义突变,12.16%)、G689A(G43E,1.35%)、T748G(S63A,1.35%)。此外还发现有一个共突变现象:T178G(D25E,59.46%)-A647G(N29S,59.46%)-T843C(同义突变,21.62%)-T846C(同义突变,60.81%)。

关键词： HPV-16 E6基因突变 E7基因突变

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树鼩血压和心率的无创测定

树鼩血压和心率的无创测定

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2014第十一届中国实验动物科学年会

作者：仝品芬陆彩霞江勤芳孙晓梅高家红匡德宣代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的建立健康树鼩的心率、血压正常值参考范围,并探讨不同来源、不同性别、不同年龄树鼩心率、血压的差异.方法随机挑选实验树鼩180只,按来源分为野生成年组、F1代自繁成年组和青幼年组三个组,每组雌雄各半,共60只.采用智能无创血压计... 详细信息

目的建立健康树鼩的心率、血压正常值参考范围,并探讨不同来源、不同性别、不同年龄树鼩心率、血压的差异.方法随机挑选实验树鼩180只,按来源分为野生成年组、F1代自繁成年组和青幼年组三个组,每组雌雄各半,共60只.采用智能无创血压计(鼠仪)逐只测定HR(心率)、SBP(收缩压)、DBP(舒张压)和MBP(平均动脉压).结果野生成年树鼩、自繁成年树鼩和青幼年树鼩心率分别为394.33±37.74BPM、351.61±72.76BPM和378.19±69.04BPM,野生和自繁成年树鼩组有显著性差异(P＜0.05),自繁成年树鼩收缩压、舒张压和平均动脉压均明显低于青幼年树鼩,有极显著性差异(P＜0.01).野生成年树鼩和自繁成年树鼩相比,收缩压、舒张压和平均动脉压均无显著性差异(P＞0.05).结论大鼠无创血压计适合于树鼩的血压、心率的测量.通过测定,获得了野生成年树鼩、F1代自繁成年树鼩和青幼年树鼩的心率和血压参考值范围,丰富了树鼩基础生理数据,可为相关研究提供科学参考.

关键词：树鼩心率血压无创测定

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树鼩骨髓间充质干细胞体外分离培养及成脂成骨诱导

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中国比较医学杂志 2014年第3期24卷 10-13,I0002,I0003页

作者：陆彩霞李晓飞王文广孙晓梅仝品芬匡德宣代解杰中国医学科学院北京协和医院医学生物学研究所树鼩种质资源中心昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的探讨树鼩骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的体外分离、传代及定向诱导为脂肪细和成骨细胞的可行性。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法对树鼩骨髓间充质干细胞进行体外分离、扩增、纯化,倒置相差显微镜进行形态学观察。用成脂诱导液(DM... 详细信息

目的探讨树鼩骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的体外分离、传代及定向诱导为脂肪细和成骨细胞的可行性。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法对树鼩骨髓间充质干细胞进行体外分离、扩增、纯化,倒置相差显微镜进行形态学观察。用成脂诱导液(DMEM/F12+10%FBS+100 U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+1.0μmol/L地塞米松+0.2 mmol/L吲哚美辛+0.01 mg/mL胰岛素+0.5 mmol/L IBMX)和成骨诱导液(高糖DMEM+10%FBS+100 U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+50 ng/mL BMP-2)对分离的树鼩BM-MSCs分别定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结果原代和传代细胞为梭形或三角形,可增殖形成克隆。BM-MSCs成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色可观察到矿化结节。结论密度梯度离心联合贴壁培养法分离培养树鼩BM-MSCs简便可行,获得的BM-MSCs可体外诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。

关键词：树鼩骨髓间充质干细胞细胞培养成脂诱导成骨诱导

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树鼩呼肠孤病毒RT-nPCR检测方法的建立及初步应用

树鼩呼肠孤病毒RT-nPCR检测方法的建立及初步应用

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2014第十一届中国实验动物科学年会

作者：李晓飞殷安国张媛罗军孙晓梅代解杰中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的建立树鼩呼肠孤病毒(TRV)RT-nPCR检测方法，为树鼩的质量控制提供检测方法.方法从三批野外来源的具有感染临床症状的树鼩粪便中分离得到三株病毒，经电镜观察和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为哺乳动物呼肠孤病毒(MRV).根据GenBank中已... 详细信息

目的建立树鼩呼肠孤病毒(TRV)RT-nPCR检测方法，为树鼩的质量控制提供检测方法.方法从三批野外来源的具有感染临床症状的树鼩粪便中分离得到三株病毒，经电镜观察和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为哺乳动物呼肠孤病毒(MRV).根据GenBank中已发表的MRV L1基因的保守区域，设计合成巢式引物，对所分离的三株树鼩呼肠孤病毒(TRV1、TRV2、TRV3)的RNA进行RT-nPCR扩增，优化反应条件，进行特异性、敏感性试验.应用RT-nPCR方法对25只野外来源的相同症状疑似病例样本进行检测.结果针对分离到的三株树鼩呼肠孤病毒的RNA进行RT-nPCR扩增，均得到513 bp的特异性目的片段，培养细胞及甲肝病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒阴性对照均未扩增出条带.敏感性试验结果显示可检测到的最小RNA模板浓度为0.01 pg/μL.25只树鼩粪便样本经RT-nPCR检测，有14只TRV阳性，其中死亡动物组10只，检出率为100％;存活动物组15只，检出率为27％.结论建立的TRV RT-nPCR检测方法特异、敏感、稳定，可用于TRV的常规检测.

关键词：树鼩哺乳动物呼肠孤病毒反转录巢式聚合酶链式反应巢式引物

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