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2014第十一届中国实验动物科学年会

作者：徐娟黄晓燕李晓飞王文广殷安国夏雪山孙晓梅代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 昆明理工大学生命科学与技术学院昆明650500

致病性病毒严重危害树鼩(tree shrew,Tupaia)生命健康,但却鲜见有关树鼩自然感染病毒的报道.该研究采集6份因腹泻死亡的野生树鼩粪便,用Vero细胞进行病毒分离,72 h后细胞发生病变,特征为颗粒增多、破碎、变圆固缩、拉网及脱落等;电镜观... 详细信息

致病性病毒严重危害树鼩(tree shrew,Tupaia)生命健康,但却鲜见有关树鼩自然感染病毒的报道.该研究采集6份因腹泻死亡的野生树鼩粪便,用Vero细胞进行病毒分离,72 h后细胞发生病变,特征为颗粒增多、破碎、变圆固缩、拉网及脱落等;电镜观察显示该病毒为球形,双层衣壳,完整直径～ 75 nm.纯化病毒经核酸PAGE电泳后呈现10个核酸节段,并为典型的3∶3∶4排列.哺乳动物呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus,MRV) L1基因保守区RT-PCR检测、序列分析及进化树构建结果表明,该病毒株属于MRV,且与来源于蝙蝠的呼肠孤病毒分离株(T3/Bat/Germany/342/08)同源性最高.MRV是人兽共患病病毒,该实验首次从树鼩体内成功分离到MRV,对今后研究制定实验树鼩病毒学控制标准具有指导意义,同时为有效预防该病毒在树鼩与人类之间传播提供了实验依据.

关键词：树鼩呼肠孤病毒分离鉴定

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2009年云南省柯萨奇病毒B3型分离株A103／KM／09全基因序列分析

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中华流行病学杂志 2013年第12期34卷 1208-1212页

作者：杨卉娟刘建生张云昆马忠飞赵卫中潘玥陈俊英邵聪文马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的分析2009年云南省脑炎患儿粪便标本分离的柯萨奇病毒B3型分离株A103／KM／09全基因序列，了解其遗传特性。方法设计针对柯萨奇病毒B3型引物，提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得全基因组序列，利用Geneious和Mega5．05软件... 详细信息

目的分析2009年云南省脑炎患儿粪便标本分离的柯萨奇病毒B3型分离株A103／KM／09全基因序列，了解其遗传特性。方法设计针对柯萨奇病毒B3型引物，提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得全基因组序列，利用Geneious和Mega5．05软件进行核苷酸、氨基酸序列比对及其系统进化分析，应用RDP3和SimPlot3．5．1重组软件对序列进行重组分析。结果该分离株全基因组核苷酸序列长度为7389bp。其核苷酸和氨基酸序列与其原型株Nancy的同源性分别为81．0％和95．7％；与其他柯萨奇病毒B3型毒株的各区段核苷酸和氨基酸同源性分别为81．0％～88．0％和95．7％～98．0％；进化分析发现CVB3可分为5个分支（I～V），核苷酸之间的差异为16．2％-24．3％；中国分离株属V分支，又可分为A～D亚分支，核苷酸之间的差异为4．3％～11．4％。并发现A103／KM／09株基因序列在非结构区可能存在重组事件。结论柯萨奇病毒B3型分为5个基因型，云南分离株A103／KM／09属于V—D亚型，而中国分离株已经发生一定进化。

关键词：柯萨奇病毒B3型全基因序列序列分析

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Ⅲ型登革病毒D9964株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应株选育纯化及其增殖动力学研究

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病毒学报 2013年第3期29卷 287-292页

作者：赵玉娇潘玥阎玲梅岳耀斐杨丽娟陈俊英马绍辉施海晶孙强明中国医学科学院、北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

选育出Ⅲ型登革病毒中国株在人胚肺二倍体细胞KMB17上的适应株并对其生物学特性和增殖动力学进行研究,为研究登革病毒减毒活疫苗奠定基础。Ⅲ型登革病毒中国株D9964经RT-PCR鉴定型别正确后,进行毒种扩增和滴度测定;以4.0MOI接种KMB17细... 详细信息

选育出Ⅲ型登革病毒中国株在人胚肺二倍体细胞KMB17上的适应株并对其生物学特性和增殖动力学进行研究,为研究登革病毒减毒活疫苗奠定基础。Ⅲ型登革病毒中国株D9964经RT-PCR鉴定型别正确后,进行毒种扩增和滴度测定;以4.0MOI接种KMB17细胞,反复传代直至病毒能在细胞中适应和增殖;连续传10代,选育出KMB17细胞适应株,经三轮噬斑纯化筛选适应株,微量滴定法检测10代病毒培养液的感染性滴度;免疫荧光法检测纯化病毒株的抗原性;将病毒纯化株接种KMB17细胞,取第3～7d细胞提取RNA,以Real-time PCR检测病毒适应株在细胞中的增殖动态。结果显示,经适应性培养后Ⅲ型登革病毒中国株D9964能在KMB17细胞中稳定增殖,经噬斑纯化获得了高纯度的细胞适应株,病毒保持了原始毒株良好的抗原性;增殖动力学研究显示第5～6d为病毒在细胞内的增殖高峰期。

关键词：登革病毒人胚肺二倍体细胞适应性增殖动力学

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铝佐剂和免疫程序对Sabin IPV免疫原性影响的研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2013年第2期27卷 102-104页

作者：王芳张名谢炳锋曹晗童少勇王俊荣俞晓平汤洋杨景然孙明波中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大疾病传染病疫苗研发重点实验室昆明550118

目的研究铝佐剂和免疫程序对不同配比的SabinIPV免疫原性的影响。方法用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒原液制备四批SabinIPV，分别为中剂量无佐剂组、中剂量铝佐剂组、低剂量无佐剂组、低剂量铝佐剂组，采用0、1、2月和0、2、4月两种免疫... 详细信息

目的研究铝佐剂和免疫程序对不同配比的SabinIPV免疫原性的影响。方法用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒原液制备四批SabinIPV，分别为中剂量无佐剂组、中剂量铝佐剂组、低剂量无佐剂组、低剂量铝佐剂组，采用0、1、2月和0、2、4月两种免疫程序对大鼠进行3针基础免疫，每针基础免疫一个月后采血，并检测免疫后血清中3个型别的中和抗体水平。结果经过3针基础免疫后，各组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中和抗体几何平均滴度均显著提高，阳转率均达到100％。对不同组别间两种免疫程序比较无显著差异，但相同条件下，0、2、4月免疫程序可诱导产生更高的抗体水平。对相同免疫程序下不同组别进行比对，添加铝佐剂组与无佐剂组相比可以诱导更高的抗体水平。结论铝佐剂和免疫程序可提高SabinIPV免疫原性。

关键词：脊髓灰质炎病毒疫苗灭活氢氧化铝佐剂,免疫免疫接种程序表中和试验

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重组人LIF融合蛋白表达纯化及其活性鉴定

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中国生物工程杂志 2013年第5期33卷 50-55页

作者：孙静王斌段志青胡凝珠李建芳李彦涵胡云章中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的:原核表达重组hLIF融合蛋白并进行诱导表达、纯化及活性鉴定。方法:将hLIF基因克隆至pThioHisA载体,构建融合表达载体pThioHisA-hLIF,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析后,Western blot检测目的蛋白的特异性... 详细信息

目的:原核表达重组hLIF融合蛋白并进行诱导表达、纯化及活性鉴定。方法:将hLIF基因克隆至pThioHisA载体,构建融合表达载体pThioHisA-hLIF,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析后,Western blot检测目的蛋白的特异性。用小鼠胚胎干细胞脱饲养层培养对纯化后的重组hLIF融合蛋白进行生物活性的鉴定。结果:降低诱导温度和延长诱导时间能增加hLIF融合蛋白的可溶性表达,纯化后的重组蛋白纯度大于95%,Western blot检测显示了良好的特异性。在脱饲养层细胞培养条件下,添加纯化的hLIF融合蛋白能够有效的维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态。结论:重组hLIF融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达,具有良好的特异性,为干细胞研究及hLIF蛋白的其他功能研究奠定了基础。

关键词：重组人LIF融合蛋白原核表达纯化小鼠胚胎干细胞生物活性鉴定

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Sabin株和野毒株脊髓灰质炎灭活疫苗在恒河猴体内不同免疫方案的比较

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中国生物制品学杂志 2013年第6期26卷 750-753页

作者：杨卉娟陈俊英和占龙李华杨耀云叶君岳俊孙强明施海晶马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大疾病传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的评价Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliovirus vaccine,sIPV)和野毒株脊髓灰质炎灭活疫苗(Wild strain inactivated poliovirus vaccine,wIPV)在恒河猴体内不同免疫方案的免疫原性。方法将25只恒河猴随机分为5组:sIPV组(免疫3剂sIPV)、sIPV/口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(oral attenuated poliovirus vaccine,OPV)组(免疫2剂sIPV后,再免疫2剂OPV)、wIPV组(免疫3剂wIPV)、wIPV/OPV组(免疫2剂wIPV后,再免疫2剂OPV)和对照组(免疫3次稀释液M199),每组5只。OPV口服接种,IPV和M199经上臂三角肌处肌肉注射,2剂间免疫间隔时间为1个月。首次免疫前和每剂免疫后1个月采血,分离血清,采用微量中和试验法测定血清中抗脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗体效价。结果除对照组外的4个试验组全程免疫结束后,恒河猴血清中均可检出较高水平的中和抗体,且所有恒河猴血清中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗体全部阳转。Ⅰ型和Ⅲ型抗体免疫应答中,接种sIPV的2个试验组中和抗体水平高于接种wIPV的2个试验组(P<0.05);Ⅱ型免疫应答中,接种wIPV的2个试验组中和抗体水平高于接种sIPV的2个试验组(P<0.05)。采用wIPV/OPV序贯免疫,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗体免疫应答均可获得与单独接种wIPV同样的效果;而采用sIPV/OPV序贯免疫,Ⅰ型抗体免疫应答效果低于单独接种sIPV,Ⅱ型抗体水平差异无统计学意义(P>0.05),Ⅲ型抗体第4剂免疫后水平也有所上升。结论 sIPV和wIPV在恒河猴体内均可诱导良好的免疫应答,初步证实了IPV/OPV序贯免疫的可行性,为今后免疫策略的制定提供了一定的实验依据。

关键词：脊髓灰质炎灭活疫苗 Sabin株野毒株序贯免疫中和抗体

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2009年云南省昆明地区柯萨奇病毒B5的遗传特性分析

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中国生物制品学杂志 2013年第6期26卷 766-770页

作者：邵聪文潘玥邓新强叶君马忠飞孙强明马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的对2009年中国云南省昆明地区柯萨奇病毒B5(Coxsackievirus group B5,CVB5)的部分VP1基因序列进行分析,以了解CVB5的遗传特性。方法收集2009年中国云南省昆明地区临床诊断为无菌性脑炎患儿的200份粪便标本,设计针对CVB的通用引物,利... 详细信息

目的对2009年中国云南省昆明地区柯萨奇病毒B5(Coxsackievirus group B5,CVB5)的部分VP1基因序列进行分析,以了解CVB5的遗传特性。方法收集2009年中国云南省昆明地区临床诊断为无菌性脑炎患儿的200份粪便标本,设计针对CVB的通用引物,利用半巢式RT-PCR扩增部分VP1基因。PCR产物直接测序后,采用Omiga和Mega 5.05等生物学软件进行核苷酸、氨基酸序列及系统进化分析。结果共分离出7株CVB5,其部分VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为92.7%～98.5%和93.6%～100.0%;与中国其他不同地区参考株的核苷酸序列同源性为80.1%～99.1%,其中与中国山东株98388-SD-CHN-1998同源性较低;与中国其他不同地区参考株的氨基酸序列同源性为84.4%～100.0%,其中与中国河南株CoxB5-Henan-2010和中国山东株98388-SD-CHN-1998之间同源性最低;与其他不同国家参考株比较,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在77.5%～89.1%和92.1%～96.3%之间;与原型株Faulkner的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.6%～80.9%和92.1%～95.4%。基因系统进化分析显示,分离的7株CVB5属于相对独立的1个分枝,中国流行株除98388-SD-CHN-1998外,构成1个分枝。结论 2009年中国云南省昆明地区CVB5流行株属于相同基因型。

关键词：柯萨奇病毒B5 VP1基因序列分析

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腮腺炎病毒临床口漱液样本的一步法实时荧光定量PCR检测

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中国生物制品学杂志 2013年第6期26卷 861-865页

作者：施海晶王晶晶陈俊英陈巍潘玥赵钢孙强明中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的建立腮腺炎病毒(mumps virus,MuV)临床口漱液样本一步法荧光定量PCR检测方法,为腮腺炎的临床诊断及免疫防控提供依据。方法对101份采集自中国南部3个省、自治区(云南、四川、广西)的临床疑似腮腺炎患者口漱液样本,分别采用细胞培养-... 详细信息

目的建立腮腺炎病毒(mumps virus,MuV)临床口漱液样本一步法荧光定量PCR检测方法,为腮腺炎的临床诊断及免疫防控提供依据。方法对101份采集自中国南部3个省、自治区(云南、四川、广西)的临床疑似腮腺炎患者口漱液样本,分别采用细胞培养-MuV特异的巢式PCR法及TaqMan探针Real-time PCR法进行检测,比较两种方法检测MuV的灵敏性。结果细胞培养-MuV特异的巢式PCR法共检出31份MuV阳性样本,系统进化分析表明,该31株MuV均属于F基因亚型;TaqMan探针Real-time PCR法共检出41份MuV阳性样本,其中包含了细胞培养-MuV特异的巢式PCR法检出的31份阳性样本,TaqMan探针Real-time RT-PCR法对MuV的检出率(40.59%)高于传统细胞培养-巢式PCR法的检出率(30.69%)。结论 TaqMan探针Real-time PCR法的灵敏性、特异性和简便性均优于传统的细胞培养-MuV特异的巢式PCR法,可应用于腮腺炎的临床诊断及免疫防控。

关键词：腮腺炎病毒口漱液实时聚合酶链反应

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流感疫苗纳米乳佐剂的研究进展

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中国生物制品学杂志 2013年第8期26卷 1190-1192,1200页

作者：刘洪卿李映波中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

纳米乳是一种新型的载药系统,作为佐剂应用于流感疫苗的研究。本文主要介绍了纳米乳佐剂的结构特点,将其应用于流感疫苗研究的诸多优势,以及纳米乳佐剂的组成成分、主要制备方法和工艺等。在此基础上,对目前国际上和国内将纳米乳佐剂应... 详细信息

纳米乳是一种新型的载药系统,作为佐剂应用于流感疫苗的研究。本文主要介绍了纳米乳佐剂的结构特点,将其应用于流感疫苗研究的诸多优势,以及纳米乳佐剂的组成成分、主要制备方法和工艺等。在此基础上,对目前国际上和国内将纳米乳佐剂应用于流感疫苗的研究进展状况作一综述。

关键词：纳米乳佐剂流感疫苗

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树鼩呼肠孤病毒的分离鉴定

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Zoological Research 2013年第2期34卷 116-120页

作者：徐娟黄晓燕李晓飞王文广殷安国夏雪山孙晓梅代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 昆明理工大学生命科学与技术学院云南昆明650500

致病性病毒严重危害树鼩（treeshrew,Tupaia）生命健康,但却鲜见有关树鼩自然感染病毒的报道。该研究采集6份因腹泻死亡的野生树鼩粪便,用Vero细胞进行病毒分离,72h后细胞发生病变,特征为颗粒增多、破碎、变圆固缩、拉网及脱落等;电镜... 详细信息

致病性病毒严重危害树鼩（treeshrew,Tupaia）生命健康,但却鲜见有关树鼩自然感染病毒的报道。该研究采集6份因腹泻死亡的野生树鼩粪便,用Vero细胞进行病毒分离,72h后细胞发生病变,特征为颗粒增多、破碎、变圆固缩、拉网及脱落等;电镜观察显示该病毒为球形,双层衣壳,完整直径-75nm。纯化病毒经核酸PAGE电泳后呈现10个核酸节段,并为典型的3：3：4排列。哺乳动物呼肠孤病毒（mammalian orthoreovirus,MRV）L1基因保守区RT-PCR检测、序列分析及进化树构建结果表明,该病毒株属于MRV,且与来源于蝙蝠的呼肠孤病毒分离株（T3/Bat/Germany/342/08）同源性最高。MRV是人兽共患病病毒,该实验首次从树鼩体内成功分离到MRV,对今后研究制定实验树鼩病毒学控制标准具有指导意义,同时为有效预防该病毒在树鼩与人类之间传播提供了实验依据。

关键词：树鼩呼肠孤病毒分离鉴定

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