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云南省2009年埃可病毒6型分离株KM57—09全基因序列分析

中华流行病学杂志 2012年第9期33卷 951-955页

作者：朱艳菊潘玥陈俊英马忠飞邓新强刘建生马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的对云南埃可病毒6型（Ech06）分离株KM57—09全基因序列进行分析和研究，了解其遗传特性。方法设计针对Ech06引物，提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得序列。利用Mega5．05、RDP3和SimPlot3．5．1等生物学软件分析全基因序... 详细信息

目的对云南埃可病毒6型（Ech06）分离株KM57—09全基因序列进行分析和研究，了解其遗传特性。方法设计针对Ech06引物，提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得序列。利用Mega5．05、RDP3和SimPlot3．5．1等生物学软件分析全基因序列。结果获得KM57—09全基因组核苷酸序列长度为7419bp，编码含2191个氨基酸残基的多聚蛋白；与其他Ech06参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为79．3％～80．2％和93．3％～94．4％，与原型株D’Amor核苷酸和氨基酸同源性分别为79．3％和93．6％。在基因组各个区段上，Ech06KM57—09分离株的2C和3A区，与HN-2-E25核苷酸同源性最高，分别为86-3％和85．0％，而其5’UTR、VP4、3D和3’UTR区则与CoxB5-Henan-2010核苷酸同源性最高，分别为91．7％、81．2％、89．7％和96．9％。在VP1区上，与中国其他省份分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为80．0％～96．0％和95．8％～99．0％，而与其他国家分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为77．6％～96．0％和95．2％-99．0％。进化分析发现Ech06可分为5个分支，中国分离株分属C和E分支，其中KM57—09属于E分支，且5个分支之间核苷酸的差异为15．6％～23．3％。3D基因序列种系进化分析以及RDP3和SimPlot3．5．1软件分析发现KM57—09序列在非结构区可能存在重组。结论Ech06可分为5个基因型，KM57—09分离株属于E基因型；中国大陆曾存在不同Ech06株传播链的流行。

关键词：埃可病毒6型全基因组序列分析

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2009年中国云南昆明地区柯萨奇病毒A组16型遗传特性分析

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中国生物制品学杂志 2012年第1期25卷 9-12页

作者：马绍辉陈俊英李华杨卉娟施海晶潘玥孙强明李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的对2009年中国云南昆明地区柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CoxA16)毒株的部分VP1区进行分析,了解CoxA16的遗传特性。方法设计针对肠道病毒A群的通用引物,采用半巢式RT-PCR扩增目的片段,对PCR产物测序;使用Omiga和Mega4.1等... 详细信息

目的对2009年中国云南昆明地区柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CoxA16)毒株的部分VP1区进行分析,了解CoxA16的遗传特性。方法设计针对肠道病毒A群的通用引物,采用半巢式RT-PCR扩增目的片段,对PCR产物测序;使用Omiga和Mega4.1等生物学软件进行核苷酸、氨基酸序列比对及病毒的系统进化分析。结果200份2009年昆明市儿童医院临床诊断为手足口病或并发脑炎疑似肠道病毒感染的患者粪便标本中有52份为CoxA16感染,其中15份来自脑炎患者。52株CoxA16病毒部分VP1区核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,核苷酸序列同源性为98.5%～100%,氨基酸序列同源性为98.8%～100%;与shzh00-2、shzh99-48和107/Toyama/1990相比较,核苷酸序列同源性为92.3%～93.8%,氨基酸序列同源性为95.3%～96.8%;与国际标准株G10相比较,核苷酸序列同源性为78.5%～80.3%,氨基酸序列同源性为93.2%～94.5%;与其他13个参考株的核苷酸序列同源性为96.6%～99.5%,氨基酸序列同源性为98.3%～100%。基因系统进化分析显示,52株CoxA16均属于B基因型的一个分支。结论 2009年中国云南昆明地区CoxA16株属于B2亚型。

关键词：柯萨奇病毒A组16型 VP1 序列分析

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柯萨奇B组1型病毒株MSH-KM9-09的分离鉴定及其VP1基因序列特征分析

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中国生物制品学杂志 2012年第12期25卷 1599-1601,1606页

作者：刘建生潘玥吉玛马忠飞叶君马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的对2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B组1型病毒(Coxsackievirus B1,CVB1)分离株MSH-KM9-09进行鉴定,并分析其VP1基因的序列特征。方法采用RD细胞和Hep-2细胞对22份疑似无菌性脑膜炎患者脑脊液标本进行病毒分离,采用微量中和试... 详细信息

目的对2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B组1型病毒(Coxsackievirus B1,CVB1)分离株MSH-KM9-09进行鉴定,并分析其VP1基因的序列特征。方法采用RD细胞和Hep-2细胞对22份疑似无菌性脑膜炎患者脑脊液标本进行病毒分离,采用微量中和试验,经WHO肠道病毒组合血清及单价血清对分离株进行鉴定,RT-PCR法扩增病毒全长VP1基因,进行序列测定,并采用Mega 4.1等软件进行分析。结果所分离的毒株经微量中和试验定型为CVB1亚型,编号为MSH-KM9-09。经RT-PCR扩增获得834 bp的VP1基因,与国内CVB1分离株核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在86.1%和97.8%以上,与国外CVB1分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为80.2%～83.2%和94.3%～96.0%;在系统进化树上,MSH-KM9-09株与国内分离株属于同一个分支,而国外分离株分属其他两个不同的分支。结论 MSH-KM9-09分离株为肠道病毒CVB1。

关键词：柯萨奇B组1型病毒 VP1基因序列分析

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Ⅱ型登革病毒D01090株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应株选育及初步鉴定

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中国生物工程杂志 2012年第11期32卷 1-7页

作者：赵玉娇潘玥阎玲梅岳耀斐杨丽娟孙强明北京协和医学院/中国医学科学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的:选育能在人胚肺二倍体细胞KMB17上稳定增殖的Ⅱ型登革病毒适应株,为研发以人源性细胞为基质的登革疫苗候选株奠定基础。方法:将Ⅱ型登革病毒中国株D01090提取病毒基因组,通过RT-PCR法进行登革病毒型别鉴定后,在C6/36和Vero细胞上... 详细信息

目的:选育能在人胚肺二倍体细胞KMB17上稳定增殖的Ⅱ型登革病毒适应株,为研发以人源性细胞为基质的登革疫苗候选株奠定基础。方法:将Ⅱ型登革病毒中国株D01090提取病毒基因组,通过RT-PCR法进行登革病毒型别鉴定后,在C6/36和Vero细胞上进行毒种扩增和滴度测定;将D01090毒株以4.0MOI接种KMB17细胞并反复传代至病毒完全适应在细胞内扩增,并连续传代10代,选育出良好的KMB17细胞适应株;病毒培养液经蔗糖梯度离心和超速离心后获得高浓度病毒液,接种KMB17细胞后通过透射电镜超薄切片检测细胞的病理变化;然后经过三轮蚀斑纯化筛选出纯化病毒株,免疫荧光法检测病毒纯化株的抗原性。结果:以Ⅱ型登革病毒中国株D01090基因组为模板,能扩增出511bp的登革病毒特异基因和119bp的Ⅱ型登革病毒型特异性基因。病毒经C6/36细胞扩增后滴度达4.5CCID50/ml,感染KMB17细胞至第三代可产生明显的细胞病变(cytopathic effect,CPE),连续传10代细胞病变速度逐渐增快,至第10代达到增殖高峰,病毒滴度达5.0CCID50/ml;将病毒感染6天后病变达+++的KMB17细胞进行超薄切片后经透射电镜观察细胞的病理变化,镜下可观察到内质网中新组装成的病毒颗粒,细胞周围产生很多分裂的小碎片,伴有游离出胞的病毒;三轮蚀斑纯化后筛选出纯化克隆,免疫荧光法检测病毒的抗原性呈阳性。结论选育出了能稳定传代且病毒扩增量高的Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株,经蚀斑纯化后仍保持较好的抗原性。

关键词：登革病毒人胚肺二倍体细胞蚀斑纯化生物学特性

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A组人轮状病毒VP3基因的原核表达及鉴定

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中国生物制品学杂志 2012年第2期25卷 152-156页

作者：张顺潘小霞袁静文喻玲陈元鼎中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的克隆并原核表达A组人轮状病毒(Rotavirus,RV)TB-Chen株结构蛋白VP3基因,并进行分子系统进化和基因分型。方法采用PCR法扩增A组人轮状病毒TB-Chen株VP3编码基因,克隆至pETL载体上,构建重组原核表达质粒pET-VP3,转化大肠杆菌BL21(DE3)... 详细信息

目的克隆并原核表达A组人轮状病毒(Rotavirus,RV)TB-Chen株结构蛋白VP3基因,并进行分子系统进化和基因分型。方法采用PCR法扩增A组人轮状病毒TB-Chen株VP3编码基因,克隆至pETL载体上,构建重组原核表达质粒pET-VP3,转化大肠杆菌BL21(DE3),并进行表达。表达的重组蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,对VP3基因进行分子系统进化及基因型分析。结果重组表达质粒pET-VP3经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为98 000,以包涵体形式存在;重组VP3蛋白可被抗SA11株全病毒豚鼠免疫血清识别;迄今发现的A组RV VP3可分为7个基因型,TB-Chen株和SA11株VP3基因分别属于M2型和M5型。结论成功原核表达了A组人RV TB-Chen株VP3蛋白,为进一步研究VP3的结构功能及开发新型RV疫苗、诊断试剂和治疗药物奠定了基础。

关键词：轮状病毒属 VP3基因原核细胞基因表达基因分型

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Ⅰ型登革病毒D06063株人二倍体细胞适应株的筛选及纯化

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中国生物制品学杂志 2012年第12期25卷 1611-1614页

作者：赵玉娇潘玥陈俊英杨丽娟岳耀斐施海晶马绍辉孙强明中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的筛选Ⅰ型登革病毒(Dengue virus,DV)中国株D06063人胚肺二倍体细胞KMB17的适应株,经噬斑纯化后,分析其生物学特性。方法将Ⅰ型DV中国株D06063在C6/36细胞上进行扩增,采用微量滴定法测定病毒的感染性滴度;RT-PCR法鉴定DV型别;病毒连... 详细信息

目的筛选Ⅰ型登革病毒(Dengue virus,DV)中国株D06063人胚肺二倍体细胞KMB17的适应株,经噬斑纯化后,分析其生物学特性。方法将Ⅰ型DV中国株D06063在C6/36细胞上进行扩增,采用微量滴定法测定病毒的感染性滴度;RT-PCR法鉴定DV型别;病毒连续以4.0 MOI的量感染KMB17细胞,传代至病毒完全适应在细胞内扩增,再连续传10代,筛选出KMB17细胞适应株,并进行3轮噬斑纯化;免疫荧光法检测纯化病毒,电镜观察病毒颗粒的形态。结果在C6/36细胞上扩增的Ⅰ型DV D06063株的滴度为6.0 lg CCID50/ml,经RT-PCR可扩增出511 bp的DV特异基因和482 bp的Ⅰ型DV型特异性基因;病毒感染KMB17细胞后,可产生明显的细胞病变,至第10代,病毒的感染性滴度达峰值,为6.75 lg CCID50/ml;纯化的病毒经免疫荧光检测呈阳性,电镜观察显示病毒形态正常。结论成功筛选出传代稳定性好、病毒扩增量高的Ⅰ型DVKMB17细胞适应株,纯化的病毒株保持了原始毒株的基本生物学特性。

关键词：登革病毒人胚肺二倍体细胞噬斑纯化生物学特性

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表达甲型H1N1流感病毒血凝素重组腺病毒的构建及免疫学评价

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现代免疫学 2012年第4期32卷 308-314页

作者：严敏孙茂盛谢天宏王文举岳磊李鸿钧中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

构建表达甲型H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)的重组腺病毒,探讨其经滴鼻和肌肉注射免疫小鼠后诱导机体产生特异性免疫应答的能力。通过人工合成HA基因,克隆其至穿梭质粒pShuttle-CMV中,经同源重组获得重组腺病毒质粒,转染Ad-293... 详细信息

构建表达甲型H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)的重组腺病毒,探讨其经滴鼻和肌肉注射免疫小鼠后诱导机体产生特异性免疫应答的能力。通过人工合成HA基因,克隆其至穿梭质粒pShuttle-CMV中,经同源重组获得重组腺病毒质粒,转染Ad-293细胞,包装携带H1N1HA基因的重组腺病毒Ad-HA。RT-PCR和免疫荧光检测HA基因在Vero细胞中成功的转录和表达。CsCl密度梯度离心纯化重组腺病毒,通过鼻腔免疫和肌肉注射免疫小鼠,ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HA抗体滴度。结果显示Ad-HA通过鼻腔免疫和肌肉注射两种途径均能刺激小鼠产生抗HA的抗体,鼻腔免疫能在初次免疫后两周刺激机体产生抗体,最高抗体效价可达1∶103.4,而肌肉注射初次免疫两周后未出现明显的免疫应答,加强免疫后抗体水平出现明显的上升,最高抗体效价可达1∶104。结果表明表达甲型H1N1流感病毒HA蛋白的重组腺病毒通过肌肉注射和滴鼻免疫两种途径均能刺激小鼠产生针对HA的IgG抗体。

关键词：甲型H1N1流感病毒血凝素重组腺病毒免疫原性

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柯萨奇病毒A组16型G20分离株在不同培养条件下的增殖动力学

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中国生物制品学杂志 2012年第8期25卷 963-966页

作者：刘尚允王丽春董承红赵恒杨二霞刘龙丁李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 昆明医学院昆明650031

目的探讨柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)G20分离株在不同培养条件下的增殖动力学。方法常规培养Vero和人二倍体KMB-17细胞,待细胞长至单层,接种G20株病毒,进行病毒蚀斑试验,以0.1 MOI的感染复数分别感染此两种细胞,置不同... 详细信息

目的探讨柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)G20分离株在不同培养条件下的增殖动力学。方法常规培养Vero和人二倍体KMB-17细胞,待细胞长至单层,接种G20株病毒,进行病毒蚀斑试验,以0.1 MOI的感染复数分别感染此两种细胞,置不同温度和pH维持液中进行培养,每2 h收样1次至第24 h,以48 h收样作为对照样,微量滴定法检测病毒滴度,并绘制增殖动力学曲线。结果 G20株病毒在Vero及KMB-17细胞中传代适应后,均可导致细胞病变。G20株病毒在此两种细胞中培养,pH 6.0、pH 6.5时,不同培养温度下,病毒基本不增殖;pH 7.5与pH 7.0的病毒增殖基本一致,增殖速度随温度呈现37℃>35℃>33℃的趋势;在33℃～37℃、pH 7.0～8.0时,病毒均有不同程度的增殖;在41℃、各pH条件下,病毒增殖均明显受到限制。结论病毒在此两种细胞中,37℃,pH 7.5培养条件下,增殖速度及滴度均较理想。

关键词：柯萨奇病毒温度 pH 增殖动力学

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重组人甲状旁腺激素(1-84)对去卵巢大鼠骨质疏松模型的影响

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中国老年学杂志 2012年第6期32卷 1185-1187页

作者：丁晨唐维坤孙茂盛何昆云严敏杨蕾尹力李鸿钧中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 昆明云健制药有限公司

目的观察重组人甲状旁腺激素(1-84)对卵巢摘除骨质疏松大鼠的治疗作用。方法 36只4月龄的SD健康雌性大鼠,26只行双侧卵巢摘除术,10只作为假手术组,6 w后各处死6只检测造模效果。余20只骨质疏松模型鼠随机分为PTH组和安慰剂组。PTH组肌... 详细信息

目的观察重组人甲状旁腺激素(1-84)对卵巢摘除骨质疏松大鼠的治疗作用。方法 36只4月龄的SD健康雌性大鼠,26只行双侧卵巢摘除术,10只作为假手术组,6 w后各处死6只检测造模效果。余20只骨质疏松模型鼠随机分为PTH组和安慰剂组。PTH组肌肉注射rhPTH(1-84)40μg/kg,每周3次。安慰剂组肌肉注射等量生理盐水,每周3次。治疗8 w后,测定并比较子宫湿重、股骨骨密度(BMD)、血清碱性磷酸酶(ALP)及吡啶酚(PYD)/Cr水平。结果双侧卵巢摘除6 w后,大鼠股骨BMD明显低于假手术组。8 w治疗后,PTH治疗组大鼠股骨BMD明显高于安慰剂组,血ALP及PYD/Cr也高于安慰剂组。结论 rhPTH(1-84)可显著增加BMD,对卵巢摘除诱导的大鼠骨质疏松有效。

关键词：重组人甲状旁腺激素去卵巢大鼠骨质疏松治疗作用

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Sabin IPV基础免疫后不同时间的中和抗体水平研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2012年第3期26卷 196-198页

作者：刘婧马艳孙明波伍胤杰周武刚谢炳锋张名唐聪杨卉娟杨晓蕾中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大疾病传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的探讨不同剂量配比的Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（SabinIPV）基础免疫后中和抗体的持续时间及加强免疫前后中和抗体水平的变化。方法用不同配比的Ⅰ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒原液制备两批SabinIPV，并使用GSK制备的DTaP—WIPV作为阳性对... 详细信息

目的探讨不同剂量配比的Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（SabinIPV）基础免疫后中和抗体的持续时间及加强免疫前后中和抗体水平的变化。方法用不同配比的Ⅰ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒原液制备两批SabinIPV，并使用GSK制备的DTaP—WIPV作为阳性对照组，对18只Wistar大鼠进行3针基础免疫后，每间隔3个月采血直到加强免疫前，并同时于加强免疫后1个月采血，并对血清中抗脊髓灰质炎病毒3个型别的中和抗体效价进行初步研究。结果大鼠采用0、1、2月免疫程序进行3针免疫后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒中和抗体的几何平均滴度随着时间的变化均有所下降，但绝大部分组大鼠的血清中和抗体阳转率仍维持在100％，在加强免疫后，各组的三个型别的中和抗体水平在短期内明显升高。结论SabinIPV有良好的免疫持久性，并在加强免疫后，可产生更高水平的中和抗体。

关键词：脊髓灰质炎病毒疫苗灭活抗体病毒

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