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中国病毒病杂志 2020年第5期10卷 355-358页

作者：丛山日刘红波许丹菡郭伟黄小琴孙浩杨昭庆马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的对2010年云南省昆明市1例手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)并发脑炎患儿的粪便中分离到的1株柯萨奇病毒A组9型(coxsackievirus A9,CV-A9)毒株的全基因组序列和遗传特性进行分析。方法利用人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyo... 详细信息

目的对2010年云南省昆明市1例手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)并发脑炎患儿的粪便中分离到的1株柯萨奇病毒A组9型(coxsackievirus A9,CV-A9)毒株的全基因组序列和遗传特性进行分析。方法利用人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞对该粪便标本进行病毒分离,提取病毒RNA,采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR)分段扩增病毒的全基因组序列,利用MEGA 6.06、Geneious 9.0.2和SimPlot 3.5.1等软件对该毒株的全基因序列进行分析。结果获得1株CV-A9分离株(A744/YN/CHN/2010,简称A744),其全基因组序列长为7319bp。该毒株与CV-A9重组株(A108/YN/CHN/2009)核苷酸一致性和氨基酸同源性最高,分别为97.4%和99.0%,可能发生重组事件。结论A744分离株为CV-A9,与中国其他CV-A9分离株同属D2基因亚型。

关键词：柯萨奇病毒A组9型全基因组进化分析遗传特性

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人柯萨奇B2病毒感染恒河猴模型的初步研究

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中国比较医学杂志 2019年第12期29卷 52-60页

作者：段素琴杨亚平杨凤梅李艳艳刘权赵远马绍辉和占龙中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室

目的通过对人柯萨奇B2病毒经口腔感染恒河猴婴猴的感染特征进行初步分析研究,为人柯萨奇B2病毒恒河猴感染模型的建立提供实验方法及技术支持,为后续开展其感染机制、病理生理等研究奠定基础。方法将柯萨奇B2病毒经口腔感染方式感染3~4... 详细信息

目的通过对人柯萨奇B2病毒经口腔感染恒河猴婴猴的感染特征进行初步分析研究,为人柯萨奇B2病毒恒河猴感染模型的建立提供实验方法及技术支持,为后续开展其感染机制、病理生理等研究奠定基础。方法将柯萨奇B2病毒经口腔感染方式感染3~4月龄的恒河猴婴猴,观察记录恒河猴临床症、体温;采集血液检测生理生化指标;血样和疱疹检测病毒;疱疹组织进行病理检测。结果恒河猴感染后2~5 d出现手、足、口疱疹;动物出现精神沉郁、活动及饮食量减少的情况;体温呈现稽留热曲线图;疱疹液和血样中都可检测到柯萨奇B2病毒;血常规检测出现白细胞减少、单核细胞增加、淋巴细胞数量减少、粒细胞数量增加、嗜酸性细胞增加、嗜碱性细胞减少的情况。血液生化检测发现肝功、肾功、心肌酶都发生了不同程度的升高;疱疹组织病理学显示恒河猴疱疹呈鳞状上皮增厚,表面角化过度,局部坏死伴炎细胞浸润,脓肿形成。结论人柯萨奇B2病毒感染婴猴后出现一系列较为特征的手足口疱疹、临床症状、生理生化、病毒血症等情况,表明经口腔感染方式恒河猴婴猴可以成功构建柯萨奇B2病毒感染的动物模型,建立的相关检测方法和技术是可行的,为后续建立开展恒河猴柯萨奇B2病毒感染模型、发病机制研究、药物及疫苗的评价奠定了实验基础。

关键词：手足口病人柯萨奇B2病毒恒河猴模型口服感染

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CA16感染树鼩肺成纤维细胞模型的建立及其受体SCARB2的表达

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中国实验动物学报 2019年第4期27卷 479-484页

作者：王文广匡德宣李娜陆彩霞罕园园仝品芬孙晓梅代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心云南省重大传染病疫苗研发重点实验室中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队

目的探讨建立CA16感染树鼩肺成纤维细胞(tree shrew lung fibroblasts,TSLF)实验模型的可行性。方法用肠道病毒CA16感染TSLF,以人肺成纤维细胞(KMB-17)作对照,镜下观察细胞病变情况,间接免疫荧光实验观察病毒蛋白和感染相关受体SCARB... 详细信息

目的探讨建立CA16感染树鼩肺成纤维细胞(tree shrew lung fibroblasts,TSLF)实验模型的可行性。方法用肠道病毒CA16感染TSLF,以人肺成纤维细胞(KMB-17)作对照,镜下观察细胞病变情况,间接免疫荧光实验观察病毒蛋白和感染相关受体SCARB2蛋白的表达情况,探针法实时荧光定量PCR检测病毒载量,以β-Actin作内参染料法实时荧光定量PCR检测受体SCARB2基因的相对表达量,结合基因序列比对,分析其与感染的相关性。结果 CA16感染TSLF,可引起明显的细胞病变,免疫荧光实验可见病毒和受体SCARB2蛋白,以100TCID50/10^5 cells的比例感染TSLF可在48 h左右病毒载量达到最高,SCARB2基因有与感染相关的高表达,而其基因序列也与人有较高同源性。结论 CA16可感染TSLF,树鼩SCARB2可参与感染。

关键词： CA16 树鼩肺成纤维细胞感染 SCARB2

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1例罕见ATR-X综合征的基因突变分析

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中风与神经疾病杂志 2021年第6期38卷 536-538页

作者：袁军鸿段丽芬刘晓梅张云茜刘红仙孙浩褚嘉祐杨昭庆昆明医科大学云南昆明650500 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所医学遗传学研究室云南昆明650118 昆明市儿童医院神经内科云南昆明650034 昆明市儿童医院感染科云南昆明650034 云南大学附属医院神经内科云南昆明650031

ATR-X综合征也称X连锁的α地中海贫血智力障碍综合征(Alpha-thalassemia X-linked intellectual disability,ATR-X;OMIM:301040),是由X染色体上的ATRX基因突变引起的罕见遗传病[1]。ATR-X综合征的致病基因位于Xq21.1,编码了2492个氨基酸,所编码的蛋白质是染色质重塑因子SNF2(SWI/SNF)家族成员,在体外具有一定的染色质重塑活性[2]。ATRX基因包含约300 kb的基因组DNA,由35个外显子组成[3,4]。ATR-X综合征的临床表现多为面部畸形、严重智力低下、轻度(或无)α-地中海贫血、生殖器不同程度的异常、骨骼异常和自闭症行为[5]。该综合征具有较广的基因突变谱和临床表型谱,但基因型与临床表型的对应关系尚不清楚。本研究通过全外显子组测序对一个核心家系中临床表现为智力低下、异常面容伴阵发性抽搐的患者进行致病基因突变筛查,发现了ATRX基因上一个单碱基致病基因突变,现报道如下。

关键词： ATR-X综合征基因突变 ATRX基因全外显子组测序表型

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抗树鼩CD4单克隆抗体的制备及其生物学特性的鉴定

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中国生物制品学杂志 2019年第10期32卷 1097-1101,1107页

作者：吴忠香张雪梅徐婧雯宋杰李慧朱文兵蒋曦李卫宇董少忠中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队云南昆明650118

目的制备鼠抗树鼩CD4单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。方法将重组质粒pGEX-5X-1-CD4和pET30a(+)-CD4分别转化感受态*** BL21和BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并通过Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱纯化重组蛋白GST-CD4和His-CD4。以His-CD4蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术筛选出能分泌抗树鼩CD4的杂交瘤细胞株,制备小鼠腹水单克隆抗体,间接ELISA法检测效价,并通过Protein A亲和层析柱纯化获得鼠抗树鼩CD4单克隆抗体,Western blot及FACS法分析其生物学特性。结果筛选出3株能稳定分泌抗树鼩CD4单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为37D2、38E1、39F2,腹水单克隆抗体效价分别为1∶204800、1∶204800、1∶3200。经HRP标记的38E1单克隆抗体可与树鼩PBMC总蛋白发生特异性结合,经PECy5.5标记的38E1单克隆抗体能特异性识别树鼩PBMC。结论成功制备了鼠抗树鼩CD4的单克隆抗体,为进一步对树鼩作为动物模型的研究及应用奠定了基础。

关键词：树鼩 CD4 单克隆抗体生物学特性

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云南汉族人群mircoRNA-149、mircoRNA-219、mircoRNA-let-7基因多态性与非小细胞肺癌发生和发展的相关性

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昆明医科大学学报 2021年第10期42卷 22-28页

作者：杨佳李娅娴王莹莹肖琳李传印谭芳马千里刘舒媛中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 昆明医科大学第一附属医院干部医疗科云南昆明650032 昆明医科大学第三附属医院胸外科云南昆明650118

目的探讨mircoRNA基因多态性与云南汉族人群非小细胞肺癌发生发展的相关性。方法选取云南地区汉族人群非小细胞肺癌患者415例,健康对照460例,采用Taqman探针基因分型法对3个SNP位点rs2292832 T>C(pre-miR-149)、rs107822 C>T(pre-... 详细信息

目的探讨mircoRNA基因多态性与云南汉族人群非小细胞肺癌发生发展的相关性。方法选取云南地区汉族人群非小细胞肺癌患者415例,健康对照460例,采用Taqman探针基因分型法对3个SNP位点rs2292832 T>C(pre-miR-149)、rs107822 C>T(pre-miR-219a-1),rs629367 C>A(pri-let-7a-1)进行基因分型并分析其等位基因、基因型在非小细胞肺癌患者(按病理分层为鳞癌、腺癌及其他类型肺癌;按临床分期分层为Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期)及健康对照中的频率差异。结果rs2292832、rs107822、rs629367位点的等位基因、基因型频率在非小细胞肺癌组和对照组间的差异没有统计学意义,在分层分析及遗传模式分析中也无显著性差异。结论rs2292832、rs107822、rs629367可能与云南汉族人群非小细胞肺癌无相关性。

关键词：非小细胞肺癌 miRNA SNPs 相关性云南汉族人群

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试验设计法优化肺炎支原体培养基

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中国生物制品学杂志 2019年第1期32卷 66-71页

作者：李双丽李泽华朱文勇陈枫李卫东廖国阳中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的试验设计(design of experiment,DOE)法优化肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)培养基,以期提高MP产量。方法以MP(FH株)为试验菌株,PPLO培养基为基础,菌体蛋白含量为响应值,采用Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验及Box-Behnken试验对脑心浸液、水解乳蛋白、胨3号、精氨酸、小牛胸腺DNA、葡萄糖和胰蛋白胨7种培养基添加成分进行筛选及优化。以菌体蛋白含量及颜色变化单位(color change unit,CCU)为指标,验证改良培养基培养MP的效果。结果培养基各添加成分对MP生长影响作用大小依次为葡萄糖、胰蛋白胨、脑心浸液、精氨酸、月胨3号、水解乳蛋白、小牛胸腺DNA,最终筛选出脑心浸液、葡萄糖及胰蛋白胨3种添加物,最适浓度分别为5. 68、1. 34及2. 64 g/L。采用改良培养基培养MP 96 h时,菌体蛋白含量及CCU达最大,分别为851. 29μg/mL及10~9 ccu/mL。结论 DOE法实现了对MP培养基的优化,获得了影响MP生长的主要参数,提高了MP菌体产量。

关键词：肺炎支原体 PPLO培养基试验设计优化

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水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E在昆虫细胞中的表达、鉴定及免疫原性分析

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中国生物工程杂志 2019年第8期39卷 17-24页

作者：齐家龙高瑞雨靳输梅高福兰杨旭马雁冰刘存宝中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明65000 云南省药物研究所云南白药集团创新研发中心云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室昆明65000

目的:利用昆虫-杆状表达系统建立表达和纯化分泌形式的水痘-带状疱疹病毒(varicellazoster virus,VZV)糖蛋白gE的方法,并鉴定其理化性质及免疫原性。方法:利用Gibson assembly同源重组试剂盒快速构建重组质粒pFastbac-VZV gE。在sf9昆... 详细信息

目的:利用昆虫-杆状表达系统建立表达和纯化分泌形式的水痘-带状疱疹病毒(varicellazoster virus,VZV)糖蛋白gE的方法,并鉴定其理化性质及免疫原性。方法:利用Gibson assembly同源重组试剂盒快速构建重组质粒pFastbac-VZV gE。在sf9昆虫细胞中鉴定序列优化前后表达量的差异,并在High Five^TM细胞中大量表达。通过Ni-NTA亲和层析方法得到高纯度gE蛋白,之后通过酶联免疫吸附试验等验证了其理化性质,并进行小鼠免疫分析其免疫原性。结果:构建了pFastbac-VZV gE1/2重组质粒,经过PCR及双酶切鉴定后均为阳性克隆。使用BAC/PAC试剂盒提取Bacmid转染sf9细胞制备杆状病毒,经Western blot检测,sf9细胞开始表达gE蛋白且随着病毒代次升高gE蛋白表达量增加。序列优化后表达量明显增加,但是大部分以胞内形式存在。通过Ni-NTA一步亲和层析获得纯度较高的gE蛋白,并与VZV单抗9C8具有较好的反应性。通过免疫小鼠产生高滴度抗体,且免疫荧光结果显示其血清可以与天然病毒上的gE抗原结合。结论:成功获得了杆状表达系统表达的gE蛋白并且纯化和鉴定了蛋白质的性质及免疫原性,为进一步研发具有自主产权的VZV亚单位疫苗研究奠定了基础。

关键词：水痘带状疱疹病毒糖蛋白gE 昆虫表达系统免疫原性

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miR-196a2和miR-499基因多态性与云南汉族人群非小细胞肺癌的相关性

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贵州医科大学学报 2021年第5期46卷 511-516页

作者：杨佳马千里李盈甫王莹莹李传印洪超朱小永肖云谭芳中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650118 昆明医科大学第三附属医院胸外科云南昆明650118 昆明医科大学第一附属医院干疗科云南昆明650032 昆明医科大学基础医学院云南昆明650500 昆明医科大学第三附属医院重症医学科云南昆明650118

目的探讨miR-196a2和miR-499基因单核苷酸多态性(SNPs)位点rs11614913和rs3746444与云南汉族人群非小细胞肺癌(NSCLC)的相关性。方法选取415例NSCLC患者作为病例组,462名健康体检者作为对照组,采用TaqMan基因分型法测定2组受试者全血基... 详细信息

目的探讨miR-196a2和miR-499基因单核苷酸多态性(SNPs)位点rs11614913和rs3746444与云南汉族人群非小细胞肺癌(NSCLC)的相关性。方法选取415例NSCLC患者作为病例组,462名健康体检者作为对照组,采用TaqMan基因分型法测定2组受试者全血基因组DNA中SNPs位点rs11614913和rs3746444的等位基因和基因型频率,使用在线软件SNPStats对2个SNPs位点的5种遗传模式进行分析,采用χ^(2)检验分析2个SNPs位点与NSCLC患者病理类型和临床分期的相关性。结果2个SNPs位点的等位基因和基因型在病例组和对照组中分布频率比较,差异无统计学意义(P>0.005);遗传模式的分析结果也未发现2个SNPs位点基因型与NSCLC有相关性(P>0.005);对病例组进行分层分析发现,rs11614913和rs3746444位点与NSCLC的病理类型具有一定的相关性(P<0.05),其中携带rs11614913等位基因C的NSCLC患者是肺腺癌的可能性更大(OR=1.388,95%CI为1.038~1.857,P=0.027),而携带rs3746444等位基因G的NSCLC患者是肺鳞癌的可能性更大(OR=9.713,95%CI为4.054~23.269,P<0.001)。结论mi R-196 a 2基因SNPs位点rs11614913和miR-499基因SNPs位点rs3746444与云南汉族人群NSCLC发生风险无相关性,但可能与NSCLC病理类型相关。

关键词：微RNAs 多态性,单核苷酸癌,非小细胞肺相关性研究云南汉族

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氧嗪酸钾致小鼠急性高尿酸血症动物模型的研究及评价

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中药药理与临床 2019年第1期35卷 176-180页

作者：王陈芸李哲丽叶尤松易红昆蔡发晶肖涵唐东红中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所小动物实验部昆明650118 云南省中医学院中药学院昆明650200

目的:通过对小鼠梯度给药,探讨氧嗪酸钾致小鼠高尿酸血症急性模型的用药剂量,并对不同的高尿酸血症动物模型进行比较,为高尿酸血症研究中动物模型的选择提供参考。方法:小鼠腹腔注射不同剂量氧嗪酸钾,诱导体内尿酸蓄积,在一定时间段内... 详细信息

目的:通过对小鼠梯度给药,探讨氧嗪酸钾致小鼠高尿酸血症急性模型的用药剂量,并对不同的高尿酸血症动物模型进行比较,为高尿酸血症研究中动物模型的选择提供参考。方法:小鼠腹腔注射不同剂量氧嗪酸钾,诱导体内尿酸蓄积,在一定时间段内对小鼠进行尾静脉采血,测定血清尿酸值,得到小鼠急性高尿酸血症模型氧嗪酸钾合适剂量;再利用实时荧光定量技术检测小鼠给药后肝脏黄嘌呤氧化/脱氢酶基因表达水平的变化。依据文献显示的大鼠和树鼩高尿酸血症动物模型氧嗪酸钾用量和肝脏黄嘌呤氧化/脱氢酶mRNA表达水平的变化对三种动物模型进行分析比较。结果:小鼠腹腔注射600 mg/kg的氧嗪酸钾在给药后1～2 h时能形成较为稳定的急性高尿酸血症;腹腔注射氧嗪酸钾1.5h后,小鼠黄嘌呤氧化酶/脱氢酶mRNA的表达水平较对照组上升2.14倍。综合本实验结果和文献分析显示氧嗪酸钾致三种动物高尿酸血症的用药剂量不同,其中树鼩所需最小。结论:尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾均能诱导出大鼠、小鼠和树鼩急性高尿酸模型,但药物的敏感性差异较大,提示树鼩可作为一种潜在的高尿酸动物模型。

关键词：小鼠大鼠树鼩氧嗪酸钾高尿酸血症黄嘌呤氧化酶/脱氢酶

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