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病毒学报 2020年第4期36卷 643-649页

作者：何金蓉齐家龙高瑞雨靳输梅杨旭马雁冰刘存宝昆明医科大学昆明650500 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明650000 云南省药物研究所云南白药集团创新研发中心云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室昆明650111

前期研究发现,细胞自噬能为人体快速提供能量,消灭掉入侵的细菌和病毒,同时对人体抗衰老有非常重要的意义;另外中性粒细胞具有免疫防御功能,并且水痘-带状疱疹病毒能引起细胞自噬,那么探讨水痘-带状疱疹病毒感染导致中性粒细胞自噬的作... 详细信息

前期研究发现,细胞自噬能为人体快速提供能量,消灭掉入侵的细菌和病毒,同时对人体抗衰老有非常重要的意义;另外中性粒细胞具有免疫防御功能,并且水痘-带状疱疹病毒能引起细胞自噬,那么探讨水痘-带状疱疹病毒感染导致中性粒细胞自噬的作用机制显得尤为重要。本研究发现水痘-带状疱疹病毒感染诱导中性粒细胞发生自噬性死亡,有助于进一步研究自噬抑制剂在抗病毒感染中的应用。其中,在人神经视网膜上皮细胞(ARPE-19)中可观察到水痘-带状疱疹病毒粒子,同时可检测到带状疱疹病毒的糖蛋白E;另外,HL-60细胞经维A酸(ATRA)刺激后诱导分化成成熟的中性粒细胞,细胞核呈分叶状,RT-PCR检测细胞的CD14/CD11b表达量升高7倍,髓过氧化物酶MPO升高1.6倍;病毒感染后细胞活力随感染剂量增加逐渐降低,Beclin-1和LC3b Ⅱ的表达与病毒的量及感染时间呈现正相关,自噬抑制剂3-ma能有效抑制由病毒感染导致的中性粒细胞自噬的发生。

关键词：水痘-带状疱疹病毒 HL-60细胞细胞自噬自噬抑制剂

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水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E在昆虫细胞中的表达、鉴定及免疫原性分析

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中国生物工程杂志 2019年第8期39卷 17-24页

作者：齐家龙高瑞雨靳输梅高福兰杨旭马雁冰刘存宝中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明65000 云南省药物研究所云南白药集团创新研发中心云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室昆明65000

目的:利用昆虫-杆状表达系统建立表达和纯化分泌形式的水痘-带状疱疹病毒(varicellazoster virus,VZV)糖蛋白gE的方法,并鉴定其理化性质及免疫原性。方法:利用Gibson assembly同源重组试剂盒快速构建重组质粒pFastbac-VZV gE。在sf9昆... 详细信息

目的:利用昆虫-杆状表达系统建立表达和纯化分泌形式的水痘-带状疱疹病毒(varicellazoster virus,VZV)糖蛋白gE的方法,并鉴定其理化性质及免疫原性。方法:利用Gibson assembly同源重组试剂盒快速构建重组质粒pFastbac-VZV gE。在sf9昆虫细胞中鉴定序列优化前后表达量的差异,并在High Five^TM细胞中大量表达。通过Ni-NTA亲和层析方法得到高纯度gE蛋白,之后通过酶联免疫吸附试验等验证了其理化性质,并进行小鼠免疫分析其免疫原性。结果:构建了pFastbac-VZV gE1/2重组质粒,经过PCR及双酶切鉴定后均为阳性克隆。使用BAC/PAC试剂盒提取Bacmid转染sf9细胞制备杆状病毒,经Western blot检测,sf9细胞开始表达gE蛋白且随着病毒代次升高gE蛋白表达量增加。序列优化后表达量明显增加,但是大部分以胞内形式存在。通过Ni-NTA一步亲和层析获得纯度较高的gE蛋白,并与VZV单抗9C8具有较好的反应性。通过免疫小鼠产生高滴度抗体,且免疫荧光结果显示其血清可以与天然病毒上的gE抗原结合。结论:成功获得了杆状表达系统表达的gE蛋白并且纯化和鉴定了蛋白质的性质及免疫原性,为进一步研发具有自主产权的VZV亚单位疫苗研究奠定了基础。

关键词：水痘带状疱疹病毒糖蛋白gE 昆虫表达系统免疫原性

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基孔肯雅病毒研究进展

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中国医药导报 2019年第19期16卷 70-73页

作者：程美慧陶玉芬刘建生刘红旗中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所感染和免疫实验室

基孔肯雅病毒(CHIKV)是一种虫媒病毒,可通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,感染率高,能够引起长达数月至数年的关节炎症状,严重者会造成残疾甚至致死。近几年来,CHIKV在全球范围内广泛传播,每年可导致数百万人感染。本文从临床症状、病理机制... 详细信息

基孔肯雅病毒(CHIKV)是一种虫媒病毒,可通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,感染率高,能够引起长达数月至数年的关节炎症状,严重者会造成残疾甚至致死。近几年来,CHIKV在全球范围内广泛传播,每年可导致数百万人感染。本文从临床症状、病理机制、诊断方法等几方面介绍了CHIKV的最新研究进展,其中CHIKV感染的病理机制是重点描述的部分,了解CHIKV感染的致病机制将有助于找到预防和治疗方法来对抗这种虫媒病毒感染。

关键词：基孔肯雅病毒虫媒病毒临床症状病理机制诊断方法

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肠道病毒EV-D68表面结构蛋白VP2、VP3的原核表达及其特异性分析

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国际免疫学杂志 2018年第5期41卷 477-485页

作者：龙海亭孔璟郑惠文李冰香张寒李恒刘玉斌范海涛于丽廖国阳孙明刘龙丁中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所呼吸道病毒实验室昆明650118 昆明学院医学检验与预防医学教研室昆明650214 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所生物制品八室昆明650118 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所廖国阳实验室昆明650118 中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院感染内科北京100730

目的原核表达肠道病毒68型(enterovirus D68,EV—D68)表面结构蛋白VP2、VP3,分析其亲和力和结合力,得到具备高结合力的、可结合特异性记忆性B细胞的EV-D68病毒表面结构蛋白。方法采用PCR法扩增EV-D68病毒的VP2、VP3蛋白基因,插入原核表... 详细信息

目的原核表达肠道病毒68型(enterovirus D68,EV—D68)表面结构蛋白VP2、VP3,分析其亲和力和结合力,得到具备高结合力的、可结合特异性记忆性B细胞的EV-D68病毒表面结构蛋白。方法采用PCR法扩增EV-D68病毒的VP2、VP3蛋白基因,插入原核表达载体pGEX-5X-1,构建重组表达质粒pGEX-5X-1-VP2和pGEX-5X-1-VP3,转化到工程菌Rosetta(DE3)pLy中,异丙基硫代半乳糖苷(i-sopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,表达的重组蛋白形成包涵体,经超声洗涤、透析复性;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel immunosorbent,SDS-PAGE)电泳、westem-blot鉴定重组蛋白;竞争性酶联免疫吸附检测(eIlzyme linked immunosorbent assay,EusA)检测蛋白VP2、VP3的蛋白活性和亲和力;藻红蛋白荧光素(phycoeryth面,PE)标记VP2和VP3重组蛋白,结合CD19-APC、CD27-nTc抗体,流式细胞术检测VP2、VP3蛋白结合特异性记忆性B细胞的情况。结果成功构建出重组表达质粒pGEX-5X-1-VP2和pGEX-5X-1-VP3,通过双酶切鉴定及测序分析,确认表达载体构建正确,通过表达纯化,成功获得EV-D68的VP2、VP3蛋白,SDS-PAGE电泳灰度扫描显示,VP2蛋白的纯度可达80%,VP3蛋白的纯度可达75%;经westem-blot和EusA鉴定,均有抗原特异性;通过竞争EusA检测,VP2亲和力常数为2.7×10^7M^-1,为中等亲和力;VP3亲和力常数为3.25×10^6M^-1,为低亲和力;通过流式细胞术可以检测到病毒攻击小鼠后脾脏细胞中的特异性记忆性B细胞。结论成功原核表达,复性纯化得到EV-D68VP2、EV-D68VP3蛋白,两个蛋白均具有较强的抗原特异性,利用流式细胞仪能检测到特异性记忆性B细胞。最终获得了具有较强结合能力,可用于分选抗原特异性记忆性B细胞的EV-D68表面结构蛋白VP2、VP3,为研究VP2、VP3蛋白的中和抗原表位及其广谱中和抗体的分选检测打下了基础。

关键词：肠道病毒68型 VP2蛋白 VP3蛋白原核表达

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EV71病毒中和表位和诺如病毒P结构域嵌合蛋白的原核表达

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中国生物工程杂志 2017年第1期37卷 1-6页

作者：李超刘波陶玉芬李昕潼刘建生刘红旗中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所感染和免疫实验室昆明650118

目的:构建肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)的线性中和抗原表位与诺如病毒P结构域融合基因的重组质粒,在大肠杆菌中表达诺如病毒P结构域与EV71中和抗原表位的嵌合蛋白。方法:根据已报道的3个EV71线性中和抗原表位的氨基酸序列,按大肠... 详细信息

目的:构建肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)的线性中和抗原表位与诺如病毒P结构域融合基因的重组质粒,在大肠杆菌中表达诺如病毒P结构域与EV71中和抗原表位的嵌合蛋白。方法:根据已报道的3个EV71线性中和抗原表位的氨基酸序列,按大肠杆菌密码子表达使用的偏好性优化和设计各线性中和抗原表位的核苷酸序列,将这些表位以单个或不同的组合克隆至含诺如病毒P结构域和GST标签的质粒中,经测序确认后,分别转化到*** BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG诱导融合蛋白表达。用GST融合蛋白纯化磁珠对融合蛋白进行纯化,最后通过免疫印迹法确认融合蛋白的表达及嵌合蛋白的抗原性。结果:测序结果表明,成功地构建了含EV71病毒3个单表位和4个串联中和抗原表位的诺如病毒P结构域重组质粒,而且这7个含线性中和抗原表位的嵌合蛋白在大肠杆菌中都以可溶形式得到了表达。免疫印迹分析表达蛋白的抗原性结果表明,表达的嵌合蛋白都能与抗诺如病毒P结构域抗血清反应。除了含单表位的SP55和SP28嵌合蛋白外,其它的嵌合蛋白均能与抗EV71病毒的抗血清反应。结论:成功地在大肠杆菌中表达了诺如病毒P结构域和EV71病毒中和抗原表位的嵌合蛋白,且具有抗原性,这为诺如病毒和EV71病毒的二价疫苗及检测方法的研发奠定了基础。

关键词：肠道病毒71型诺如病毒中和抗原表位亚单位疫苗

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尼古丁在诱导的肺泡巨噬细胞自噬及肺炎中的作用

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生物技术通讯 2019年第1期30卷 25-30页

作者：吴菲靳输梅李晓艳邱炜杨国菊张婷娟齐家龙缪娇丽赵红宇云南省第三人民医院云南昆明650000 云南省药物研究所云南白药集团创新研发中心云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室云南昆明650000 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650000 云南省华宁县人民医院云南昆明650000

目的:探讨尼古丁在诱导的小鼠肺泡巨噬细胞自噬及肺炎发生中的作用。方法:通过碘化丙啶(PI)/Hochest33258染色法检测尼古丁诱导巨噬细胞MH-S死亡;通过Western印迹和电子透射显微镜检测尼古丁诱导MH-S细胞自噬的发生;采用中性红摄取实验... 详细信息

目的:探讨尼古丁在诱导的小鼠肺泡巨噬细胞自噬及肺炎发生中的作用。方法:通过碘化丙啶(PI)/Hochest33258染色法检测尼古丁诱导巨噬细胞MH-S死亡;通过Western印迹和电子透射显微镜检测尼古丁诱导MH-S细胞自噬的发生;采用中性红摄取实验检测尼古丁处理后巨噬细胞的吞噬能力;通过攻毒实验检测尼古丁诱导的肺炎。结果:不同浓度尼古丁作用下PI染色的死细胞呈上升趋势;LC3BⅡ蛋白表达具有尼古丁剂量依赖性,并且1μmol/L的尼古丁能够增强LPS预刺激的MH-S细胞自噬发生。电子透射显微镜结果显示在1μmol/L尼古丁的作用下,细胞内自噬体数量增加;MH-S的中性红摄取能力与尼古丁浓度剂量呈负相关性;尼古丁能够诱导小鼠发生肺炎,并降低小鼠体重。结论:尼古丁能够增强肺泡巨噬细胞的自噬水平,并且可以诱导肺炎的发生,有助于进一步研究吸烟与肺炎的关系。

关键词：尼古丁巨噬细胞细胞自噬肺炎模型

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LPS/D-gal诱导小鼠急性肝炎模型及mTOR信号的变化

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中国实验动物学报 2015年第3期23卷 306-311页

作者：李晓菲陶玉芬刘建生李超梁新新叶尤松唐东红刘红旗中国医学科学院和北京协和医学院医学生物学研究所感染与免疫学实验室昆明650118 中国医学科学院医学生物学研究所小动物实验部昆明650118

目的探索LPS/D-gal诱导的急性肝炎中mTOR信号的变化。方法LPS/D-gal通过腹腔注射ICR雌性小鼠诱导急性肝炎模型。观察记录24h内的存活率或在注射后6h收集血清和肝脏组织样本,进行相关的分析。结果LPS/D-gal注射24h内引起小鼠急性死亡。... 详细信息

目的探索LPS/D-gal诱导的急性肝炎中mTOR信号的变化。方法LPS/D-gal通过腹腔注射ICR雌性小鼠诱导急性肝炎模型。观察记录24h内的存活率或在注射后6h收集血清和肝脏组织样本,进行相关的分析。结果LPS/D-gal注射24h内引起小鼠急性死亡。注射后6h,引起血清中转氨酶水平明显升高。肝脏组织炎性因子Tnfa和Il6表达水平上调。HE染色显示明显的炎症细胞浸润,研究结果表明LPS/D-gal可诱导ICR小鼠成为急性肝炎动物模型。此外,肝脏组织免疫印迹分析发现,mTOR和NF-κB信号通路被激活,凋亡相关蛋白Caspase-3的活性增加,凋亡特征性的DNA片段化也显著增强。然而mTOR信号的抑制剂雷帕霉素并不能控制LPS/D-gal引起的肝脏凋亡和提高存活率。结论mTOR信号在LPS/D-gal诱导的急性肝炎的致病机制中可能发挥多重作用。

关键词： LPS/D-gal 急性肝炎凋亡小鼠模型

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二株不同基因型树鼩呼肠孤病毒的分离和鉴定

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中国实验动物学报 2015年第4期23卷 365-370页

作者：刘建生陶玉芬李晓菲李超李晓飞孙晓梅代解杰刘红旗中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所感染和免疫实验室云南昆明650118 中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心云南昆明650118

目的从腹泻树鼩的粪便样本中分离和鉴定病毒。方法树鼩腹泻粪便样本分别接种Vero、LLCMK2和KMB17细胞,经连续传代,观察记录细胞病变,并对培养上清进行透射电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析、轮状病毒鉴别筛查、S1全长基因片段扩增和生物... 详细信息

目的从腹泻树鼩的粪便样本中分离和鉴定病毒。方法树鼩腹泻粪便样本分别接种Vero、LLCMK2和KMB17细胞,经连续传代,观察记录细胞病变,并对培养上清进行透射电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析、轮状病毒鉴别筛查、S1全长基因片段扩增和生物信息学分析。结果树鼩腹泻粪便样品在KMB17、Vero和LLC-MK2细胞上经连续3代次传代后,均能产生细胞病变。经电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析和轮状病毒鉴别筛查,推测其为呼肠孤病毒。病毒基因组全长S1基因扩增、序列测定和分析结果表明,KMB17培养上清中获得的病毒与I型原型株T1L同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和90%,因此该病毒定义为呼肠孤病毒I型。而LLC-MK2和Vero细胞上清中的病毒S1基因与III型原型株T3D核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和92%,因此为呼肠孤病毒III型。结论对今后树鼩和其他宿主呼肠孤病毒的分离鉴定有一定的指导意义。

关键词：哺乳动物呼肠孤病毒树鼩基因型 S1基因血清型

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LPS/D-gal诱导小鼠急性肝炎模型及mTOR信号的变化

LPS/D-gal诱导小鼠急性肝炎模型及mTOR信号的变化

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第十四届中国西部实验动物管理与学术交流会

目的探索LPS/D-gal诱导的急性肝炎中mTOR信号的变化.方法 LPS/D-gal通过腹腔注射ICR雌性小鼠诱导急性肝炎模型.观察记录24h内的存活率或在注射后6h收集血清和肝脏组织样本,进行相关的分析.结果 LPS/D-gal注射24h内引起小鼠急性死亡.注... 详细信息

目的探索LPS/D-gal诱导的急性肝炎中mTOR信号的变化.方法 LPS/D-gal通过腹腔注射ICR雌性小鼠诱导急性肝炎模型.观察记录24h内的存活率或在注射后6h收集血清和肝脏组织样本,进行相关的分析.结果 LPS/D-gal注射24h内引起小鼠急性死亡.注射后6h,引起血清中转氨酶水平明显升高.肝脏组织炎性因子Tnf和Il6表达水平上调.HE染色显示明显的炎症细胞浸润,研究结果表明LPS/D-gal可诱导ICR小鼠成为急性肝炎动物模型.此外,肝脏组织免疫印迹分析发现,mTOR和NF-κB信号通路被激活,凋亡相关蛋白Caspase-3的活性增加,凋亡特征性的DNA片段化也显著增强.然而mTOR信号的抑制剂雷帕霉素并不能控制LPS/D-gal引起的肝脏凋亡和提高存活率.结论 mTOR信号在LPS/D-gal诱导的急性肝炎的致病机制中可能发挥多重作用.

关键词： LPS/D-gal 急性肝炎凋亡小鼠模型

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2株不同基因型树鼩呼肠孤病毒的分离和鉴定

2株不同基因型树鼩呼肠孤病毒的分离和鉴定

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第十四届中国西部实验动物管理与学术交流会

作者：刘建生陶玉芬李晓菲李超李晓飞孙晓梅代解杰刘红旗中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所感染和免疫学实验室云南昆明650118 中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心云南昆明650118

目的从腹泻树鼩的粪便样本中分离和鉴定病毒。方法树鼩腹泻粪便样本分别接种Vero、LLC-MK2和KMB17细胞,经连续传代,观察记录细胞病变,并对培养上清进行透射电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析、轮状病毒鉴别筛查、S1全长基因片段扩增和... 详细信息

目的从腹泻树鼩的粪便样本中分离和鉴定病毒。方法树鼩腹泻粪便样本分别接种Vero、LLC-MK2和KMB17细胞,经连续传代,观察记录细胞病变,并对培养上清进行透射电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析、轮状病毒鉴别筛查、S1全长基因片段扩增和生物信息学分析。结果树鼩腹泻粪便样品在KMB17、Vero和LLC-MK2细胞上经连续3代次传代后,均能产生细胞病变。经电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析和轮状病毒鉴别筛查,推测其为呼肠孤病毒。病毒基因组全长S1基因扩增、序列测定和分析结果表明,KMB17培养上清中获得的病毒与Ⅰ型原型株T1L同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为85％和90％,因此该病毒定义为呼肠孤病毒Ⅰ型。而LLC-MK2和Vero细胞上清中的病毒S1基因与Ⅲ型原型株T3D核苷酸和氨基酸同源性分别为85％和92％,因此为呼肠孤病毒Ⅲ型。结论通过3种细胞和S1基因片段特异性引物从同一粪便样品中分离和鉴定了2个不同基因型呼肠孤病毒,对今后树鼩和其他宿主呼肠孤病毒的分离鉴定有一定的指导意义。

关键词：哺乳动物呼肠孤病毒树鼩基因型 S1基因血清型

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