检索结果-内蒙古大学图书馆

中国生物制品学杂志 2018年第1期31卷 14-17,23页

作者：李嘉祺李洪哲郑惠文宁若彤范海涛杨泽宁胡雅洁刘龙丁中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的构建柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)c DNA感染性克隆。方法提取CA16基因组RNA,经RT-PCR得到基因组全长c DNA,插入至TOPO-XL-PCR载体,获得CA16全长c DNA克隆。采用T7聚合酶系统将线性基因组c DNA体外转录出病毒基因组R... 详细信息

目的构建柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)c DNA感染性克隆。方法提取CA16基因组RNA,经RT-PCR得到基因组全长c DNA,插入至TOPO-XL-PCR载体,获得CA16全长c DNA克隆。采用T7聚合酶系统将线性基因组c DNA体外转录出病毒基因组RNA,纯化后转染Vero细胞,获得拯救病毒。通过RT-PCR、基因测序及免疫荧光法对拯救病毒进行鉴定,并对拯救病毒与母本病毒的增殖特性进行比较。结果病毒基因组RNA转染Vero细胞后48 h,可见典型的肠道病毒致细胞病变。拯救病毒经RT-PCR、基因测序和免疫荧光鉴定为CA16,且与母本野生型病毒增殖特性基本一致。结论成功构建了具有感染性的CA16全长c DNA克隆,为研究CA16基因功能和研发CA16新型疫苗奠定了基础。

关键词：柯萨奇病毒A组16型感染性克隆病毒拯救

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一种改进型基于荧光蛋白重定位系统的丙型肝炎病毒滴度检测方法的建立

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中国生物制品学杂志 2018年第2期31卷 181-187页

作者：毕研伟李智华龙琼张辉陈晨李亚东李育中寸韡中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的建立一种简单、快速检测丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染的荧光细胞系检测系统,并用其检测HCV滴度。方法通过RT-PCR法获得干扰素β启动刺激因子-1(interferon beta promoter stimulator-1,IPS-1)蛋白C-端第462-540位氨基酸... 详细信息

目的建立一种简单、快速检测丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染的荧光细胞系检测系统,并用其检测HCV滴度。方法通过RT-PCR法获得干扰素β启动刺激因子-1(interferon beta promoter stimulator-1,IPS-1)蛋白C-端第462-540位氨基酸(C462-540)的基因序列及含有SV40核定位信号的IPS-1(C462-540)基因序列,插入经同样酶切的慢病毒表达载体LV-CAG--EGFP-WPRE、LV-CAG—mCherry(RFP)-WPRE,构建表达EGFP-IPS-1(C462-540)、RFP-NLS-IPS-1(C462-540)的慢病毒重组表达质粒;在此基础上构建含有IPS-1(C462-540)-2A-EGFP-puro、IPS-1(C462-540)-IRES-EGFP-puro的慢病毒重组表达质粒;利用293T细胞包装含有IPS-1(C462-540)蛋白的重组慢病毒;感染Huh7.5细胞,流式细胞仪筛选稳定表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)、红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的Huh7.5细胞,或用puromycin筛选稳定表达EGFP的Huh7.5细胞;利用10倍系列稀释的HCV感染上述细胞,检测HCV的滴度。结果测序表明4种慢病毒表达质粒构建正确;收获的慢病毒感染Huh7.5细胞48 h后,可见EGFP或RFP表达,经流式细胞仪分选获得了稳定表达EGFP-IPS-1(C462-540)、RFP-IPS-1(C462-540)的细胞系,经puromycin筛选获得了稳定表达EGFP-IPS-1(C462-540)的细胞系;经10倍系列稀释的HCV感染后,弥散在细胞质中的点状EGFP、RFP会扩散到整个细胞或定位到细胞核中,在甲基纤维素的限制下形成明显的荧光噬斑点,通过计算荧光噬斑点数得到用Huh7.5-EGFP-IPS-1(462-540)-IRES-PURO、Huh7.5两种细胞检测的HCV滴度分别为(5.6±0.2)×10~5和(5.5±0.2)×10~5 PFU/mL,二者无显著差异。结论成功构建了含有绿色荧光或红色荧光报告系统的细胞系,建立了一种简单、快速检测HCV滴度的新方法。

关键词：干扰素β启动刺激因子-l 丙型肝炎病毒病毒滴度慢病毒荧光蛋白 Huh7.5细胞

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肠道病毒71型鼠源性中和单克隆抗体的制备

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中国生物制品学杂志 2018年第3期31卷 257-261页

作者：朱文兵严丽蔚巩蔚张雪梅吴忠香徐婧雯宋杰董少忠中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的制备肠道病毒71型(enterovirus A 71,EV71)鼠源性中和单克隆抗体。方法以灭活EV71病毒液为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得抗EV71单克隆抗体;ELISA法检测抗体的特征,获得具有高效结合性的单克隆抗体;SDS-PAGE和Western blo... 详细信息

目的制备肠道病毒71型(enterovirus A 71,EV71)鼠源性中和单克隆抗体。方法以灭活EV71病毒液为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得抗EV71单克隆抗体;ELISA法检测抗体的特征,获得具有高效结合性的单克隆抗体;SDS-PAGE和Western blot法鉴定Protein A纯化的抗体;通过体外和体内中和试验鉴定抗体的中和特性。结果得到3株针对EV71 VP1的高效结合性单克隆抗体15H7、15G7和6G2,且15H7经中和试验证明具有较强的中和活性。结论成功制备了EV71鼠源性中和单克隆抗体,其在小鼠体内能成功地抑制病毒增殖。

关键词：肠道病毒71型单克隆抗体中和作用

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Ⅱ型登革病毒前膜抗体对该病毒在THP-1细胞中复制能力的影响

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中国生物制品学杂志 2018年第2期31卷 125-128页

作者：姜黎明杨佳佳罗佳叶超文送娇孙强明中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的探讨Ⅱ型登革病毒(dengue virusⅡ,DENVⅡ)前膜(presynaptic membrane,prM)抗体对DENVⅡ在THP-1细胞中复制能力的影响。方法采用不同稀释度(1/4~1/16 384)的DENVⅡanti-pr M单克隆抗体分别与不同MOI的DENVⅡ(MOI分别为3、0.75及0.19)复合感染THP-1细胞。建立DENVⅡ荧光定量PCR检测标准曲线,检测THP-1细胞培养上清液的病毒拷贝数。结果 DENVⅡ按MOI=3感染THP-1细胞,当prM稀释度为1/16和1/16 384时诱发THP-1细胞产生病毒的载量较高,prM稀释度为1/64和1/256时抑制病毒生长;DENVⅡ按MOI=0.75感染THP-1细胞,当prM稀释度1/16时可诱发更高浓度病毒载量;DENVⅡ按MOI=0.19感染THP-1细胞时,不会诱导产生高浓度的病毒载量。结论中浓度pr M抗体可抑制DENVⅡ在THP-1细胞中的复制能力,而高及低浓度prM抗体可促进DENVⅡ在THP-1细胞中的复制能力。

关键词： Ⅱ型登革病毒前膜抗体 THP-1细胞复制能力

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CD44基因多态性与宫颈癌及非小细胞肺癌的相关性

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中国癌症杂志 2019年第4期29卷 277-283页

作者：赵雨笛谭芳严志凌李盈甫戴书颖周紫云张新文刘舒媛史荔姚宇峰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 昆明医科大学第一附属医院干部医疗科云南昆明650032 昆明医科大学第三附属医院妇科云南昆明650118 昆明医科大学基础医学院云南昆明650500 昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室云南昆明650500

背景与目的:CD44分子是众多肿瘤细胞的标志分子,其表达水平与肿瘤细胞的恶性程度有关。该研究探讨CD44基因中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点与云南汉族人群宫颈癌和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer... 详细信息

背景与目的:CD44分子是众多肿瘤细胞的标志分子,其表达水平与肿瘤细胞的恶性程度有关。该研究探讨CD44基因中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点与云南汉族人群宫颈癌和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)易感性的相关性。方法:选取了CD44基因中的两个SNP位点rs13347和rs8193,采用TagMan基因分型的方法,分析这两个多态性位点在497例宫颈癌患者和500例健康对照个体以及483例NSCLC患者和471例健康对照个体中的分布特征,并分析CD44基因中的多态性位点与云南汉族人群宫颈癌和NSCLC的相关性。结果:rs13347和rs8193位点等位基因和基因型在宫颈癌组和对照组中的分布频率的差异无统计学意义(P>0.05)。而在NSCLC组和对照组的比较中:rs13347和rs8193位点等位基因在NSCLC组和对照组中的分布频率的差异有统计学意义(P=0.020和P=0.004);这两个位点基因型在NSCLC组和对照组中分布频率的差异有统计学意义(P=0.027和P=0.020);其中rs13347位点等位基因C在NSCLC组中的分布频率显著高于对照组,可能是NSCLC发生的风险因素(OR=1.250,95%CI:1.035~1.509),rs8193位点等位基因C在对照组中的分布频率显著高于NSCLC组,可能是NSCLC发生的保护性因素(OR=0.768,95%CI:0.641~0.921)。单倍型分析结果显示,rs13347C-rs8193T和rs13347T-rs8193C在NSCLC组和对照组中的分布频率差异有统计学意义(P=0.003和0.022);该结果说明单倍型rs13347C-rs8193T可能是云南汉族人群NSCLC发生的风险性因素(OR=1.316,95%CI:1.096~1.579)。结论:CD44基因中的两个SNP位点rs13347和rs8193可能与云南汉族人群宫颈癌发病风险无关,而可能与云南汉族人群NSCLC具有相关性。

关键词：宫颈癌非小细胞肺癌恶性肿瘤 CD44 单核苷酸多态性遗传易感性云南汉族人群

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猴源轮状病毒SA11株Balb/c乳鼠动物模型的建立

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生物学杂志 2018年第6期35卷 22-26页

作者：乔洪图周艳尹娜陈林林刘洋苏婷孙茂盛李鸿钧中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

建立轮状病毒(rotavirus,RV) SA-11株Balb/c乳鼠动物模型,研究其发病机制,为后续疫苗保护性评价奠定基础。用不同剂量的SA11毒株单次灌胃感染7 d龄的Balb/c乳鼠,于感染后不同时间点观察其腹泻、活动能力及精神状态等生理指标,并解剖乳鼠... 详细信息

建立轮状病毒(rotavirus,RV) SA-11株Balb/c乳鼠动物模型,研究其发病机制,为后续疫苗保护性评价奠定基础。用不同剂量的SA11毒株单次灌胃感染7 d龄的Balb/c乳鼠,于感染后不同时间点观察其腹泻、活动能力及精神状态等生理指标,并解剖乳鼠,取其心、肝、脾、肺、小肠及肾等组织。免疫组化和免疫荧光检测轮状病毒抗原分布,HE染色观察小肠形态学改变,组织细胞原位凋亡检测观察攻毒后小肠绒毛细胞的凋亡情况。研究发现,高剂量和中剂量攻毒组在攻毒24 h后全组乳鼠即可发生明显腹泻,对照组和低剂量组乳鼠无腹泻发生。攻毒72 h后解剖乳鼠,高、中剂量攻毒组的乳鼠肠道可见明显充血及肠胀气,病理切片HE染色显示小肠绒毛发生大量空泡变性及小肠绒毛顶端破损,小肠绒毛原位凋亡检测可见其顶端细胞发生大量凋亡,免疫荧光检测发现在乳鼠的小肠绒毛顶端及肾脏的肾小球位置均有RV抗原分布。成功构建了猴源轮状病毒SA11株Balb/c乳鼠动物模型,研究发现轮状病毒除感染乳鼠小肠绒毛导致其病变破损发生腹泻外,还可感染肾脏等肠道外器官,引起肠道外感染。

关键词：轮状病毒动物模型 Balb/c乳鼠发病机制

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树鼩肺成纤维细胞的分离、鉴定和传代培养

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实验动物与比较医学 2019年第2期39卷 105-110页

作者：王文广匡德宣陆彩霞罕园园李娜仝品芬孙晓梅代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南省眼科疾病防治研究重点实验室中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队昆明650118

目的建立适用于树鼩肺成纤维细胞的分离、鉴定和传代培养方法。方法分别采用组织块贴壁培养法和胰酶消化法,分离培养新生树鼩肺成纤维细胞,通过倒置显微镜观察细胞生长情况,用波形蛋白(Vimentin)对分离的成纤维细胞进行免疫荧光鉴定;传... 详细信息

目的建立适用于树鼩肺成纤维细胞的分离、鉴定和传代培养方法。方法分别采用组织块贴壁培养法和胰酶消化法,分离培养新生树鼩肺成纤维细胞,通过倒置显微镜观察细胞生长情况,用波形蛋白(Vimentin)对分离的成纤维细胞进行免疫荧光鉴定;传代培养并开展冻存复苏实验,采用MTS法绘制细胞生长曲线,以人胚肺二倍体成纤维细胞(KMB-17)作对照。结果通过组织块贴壁培养法和胰酶消化法均可获取树鼩肺成纤维细胞,细胞主要呈现梭形,波形蛋白免疫荧光鉴定普遍呈阳性,与KMB-17一致。树鼩肺成纤维细胞可连续传代4～5次,经冻存复苏后细胞仍能保持活力,以5×10~4细胞/mL的密度传代,细胞可在3 d左右进入对数生长期。结论组织块贴壁培养法和胰酶消化法均可有效获取树鼩的肺成纤维细胞,可为肺部相关疾病的体外研究提供实验材料。

关键词：树鼩肺成纤维细胞鉴定传代培养

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云南汉族人群CCR5基因启动子多态性与HCV慢性感染的关系

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贵州医科大学学报 2019年第1期44卷 18-25页

作者：陈珺刘舒媛聂磊朱永玉李传印刘楠楠周紫云史荔张淑琼中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 昆明市第三人民医院云南昆明650041

目的:研究云南汉族人群CCR5基因启动子单核苷酸多态性位点(SNPs)与丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染的关系。方法:选取356例云南汉族HCV慢性感染者作为病例组,353例健康体检者作为对照组,采用PCR法扩增受检者CCR5基因启动子区基因序列;然后采... 详细信息

目的:研究云南汉族人群CCR5基因启动子单核苷酸多态性位点(SNPs)与丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染的关系。方法:选取356例云南汉族HCV慢性感染者作为病例组,353例健康体检者作为对照组,采用PCR法扩增受检者CCR5基因启动子区基因序列;然后采用Sanger法对扩增序列进行测序并与Gen Bank(NC_000003.12)序列比较获得与云南省汉族人群具有多态性的SNPs位点,对获得的SNPs位点进行基因分型,计算这些SNPs位点的等位基因频率和基因型频率;构建单倍型并分析遗传模式进行,比较两组间的分布差异。结果:在CCR5基因启动子区域有9个SNPs位点,其中rs2227010(A>G)、rs2734648(T>G)、rs1799987 (G>A)、rs1799988 (T>C)、rs1800023 (G>A)及1800024 (C>T) 6个位点在云南省汉族人群中具有多态性;这6个SNPs位点的基因型频率、等位基因频率及单倍型频率在病例组与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:CCR5基因启动子中的rs2227010(A>G)、rs2734648(T>G)、rs1799987 (G>A)、rs1799988 (T>C)、rs1800023 (G>A)及1800024 (C>T) SNPs位点与云南汉族人群HCV慢性感染无关。

关键词：基因多态性,单核苷酸肝炎,丙型 CCR5 肝炎病毒慢性感染云南汉族

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人用疫苗及生产用细胞中猪圆环病毒PCR检测方法的建立及验证

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中国生物制品学杂志 2018年第5期31卷 543-546,551页

作者：钱兴丽任芳芳宋彩花段男李娅娴陈巍赵勇袁梅李亚东俞建昆杨晓蕾洪超中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所质量检定室云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的建立人用疫苗及生产用细胞中猪圆环病毒1型(porcine circovirus 1,PCV1)和2型(PCV2)PCR检测方法,并进行验证。方法参照Gen Bank中登录的PCV1(KC447455)和PCV2(AY578327)序列,全基因组合成PCV1和PCV2基因序列,以合成的PCV1和PCV2全基因组序列DNA为模板,进行PCR扩增,对PCR反应中的退火温度进行优化。对优化后的PCR方法进行灵敏度和特异性验证,并用该方法检测疫苗生产用细胞KMB_(17)、Vero工作种子批、脊髓灰质炎减毒活疫苗(oral poliomyelitis vaccine,OPV)收获液、冻干甲型肝炎减毒活疫苗(freeze-dried hepatitis A vaccine,f HAV)成品、肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗收获液及成品、Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliomyelitis vaccine prepared with Sabin strain,SIPV)收获液及成品的PCV1和PCV2。结果优化后的退火温度为63℃,建立的PCR方法最低可检测出10^(-1)fg/μL的目的基因,仅对PCV基因组DNA能扩增出特异性条带。用该方法检测生产用细胞KMB_(17)及Vero工作种子批、OPV收获液、f HAV成品、EV71灭活疫苗收获液及成品、SIPV收获液及成品,均未检出PCV1和PCV2。结论成功建立了生产用细胞种子、疫苗收获液及成品中PCV的PCR检测方法,该方法具有较高的灵敏度和较强的特异性,能够用于本所生物制品生产用细胞种子、疫苗收获液及成品中PCV污染的检测,从而提高生物制品的安全性。

关键词：疫苗细胞猪圆环病毒聚合酶链式反应

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云南汉族人群HLA-DM基因多态性与HCV慢性感染的相关性分析

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贵州医科大学学报 2019年第5期44卷 524-529页

作者：陈珺杨瑾刘楠楠刘舒媛李传印张新文史荔张淑琼中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 昆明市第三人民医院云南昆明650041

目的:研究云南汉族人群中HLA-DM基因多态性与丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染的关系。方法:选取云南汉族人群HCV慢性感染者185人(病例组),健康对照180人(对照组),采用Sanger测序法和TA克隆测序法对HLA-DMA,HLA-DMB基因进行基因分型,计算这两... 详细信息

目的:研究云南汉族人群中HLA-DM基因多态性与丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染的关系。方法:选取云南汉族人群HCV慢性感染者185人(病例组),健康对照180人(对照组),采用Sanger测序法和TA克隆测序法对HLA-DMA,HLA-DMB基因进行基因分型,计算这两个基因在病例组和对照组中的等位基因频率和基因型频率;构建单倍型,比较两组间的分布差异。结果:在病例组和对照组中,共检出4种HLA-DMA等位基因和5种HLA-DMB等位基因,DMA*01∶01-DMB*01∶03单倍型在病例组中的频率显著高于对照组(0.287vs0.197,OR=0.134,95%CI为1.529~2.305,P=0.005),DMA*01∶02-DMB*01∶03单倍型在病例组中的频率显著低于对照组(0.024vs0.056,OR=0.424,95%CI为0.194~0.944,P=0.031)。结论:单倍型DMA*01∶01-DMB*01∶03和DMA*01∶02-DMB*01∶03可能与云南汉族人群HCV慢性感染相关。

关键词： HLA-DM 肝炎,丙型慢性感染云南汉族基因多态性等位基因

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