目的:优化人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1(human papillomavirus type 16 major capsid protein L1,HPV16L1)在毕赤酵母中的表达,并考察可能的影响因素。方法:四个不同序列特征的HPV16L1基因M16、Y16、P16、W16(其中,M16和Y16按酵母密...
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目的:优化人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1(human papillomavirus type 16 major capsid protein L1,HPV16L1)在毕赤酵母中的表达,并考察可能的影响因素。方法:四个不同序列特征的HPV16L1基因M16、Y16、P16、W16(其中,M16和Y16按酵母密码子优化,P16为哺乳动物细胞密码子优化,而W16为野生型序列)分别克隆于毕赤酵母表达质粒p PinkTM-HC(高基因拷贝菌落筛选)和p PinkTM-LC(低基因拷贝菌落筛选),并转化不同蛋白酶缺陷的宿主菌。甲醇诱导24小时后,取菌体样品经Western blot分析L1蛋白的表达。结果:M16显示了最高的表达水平,其次是Y16与P16,而W16几乎无表达。基因序列密码子应用特征分析显示,4个基因的密码子适应指数从高到低依次为Y16、M16、W16和P16。通过自由能和GC含量分析4个序列的mRNA二级结构,Y16为-409.40 kcal/mol和43.85%;M16为-451.50 kcal/mol和47.83%;P 16为-606.50kcal/mol and 64.10%;W16为-384.70 kcal/mol and 38.01%。蛋白酶缺陷菌株L1表达高于野生型菌株,质粒p PinkTM-HC与p PinkTM-LC介导的表达无明显区别。结论:密码子优化操作显著改善了HPV16L1在毕赤酵母中的表达,但表达水平与密码子利用优劣并不完全对应,提示密码子优化仅是部分原因,而mRNA结构与稳定性变化值得探讨。蛋白酶缺陷菌株提高了HPV16L1蛋白的稳定性,显著影响了表达水平。研究证明基因剂量对HPV16L1的表达未产生明显影响。
通过单因素试验和Box-Behnken实验设计考察在蛋白去除过程中b型流感嗜血杆菌荚膜多糖浓度、Tween 80及(NH_4)_2SO_4含量对多糖回收率及蛋白残留含量的影响,建立回归模型.预测荚膜多糖质量浓度8.54mg/mL、Tween 80质量分数12.9%、(NH_4)_2SO_4质量分数28.12%为该方法的最佳参数组合,并通过实验进行验证其符合度分别达到93.9%和90.3%,符合度较高.研究通过实验设计(design of experiments,DOE)试验建立并优化了Hib荚膜多糖中杂蛋白的新方法,能够应用于实际的生产工艺中.
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