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第十六届中国西部实验动物管理与学术研讨会

作者：苗雨润宋庆凯匡德宣陈玲霞尹博文李晓飞代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室树鼩种质资源中心昆明650118

目的为了分离得到可以应用于树鼩建立人类心血管病理、毒理细胞模型的纯度较高、活力较强的心肌细胞和心肌成纤维细胞.方法使用差速贴壁1.5 h纯化心肌细胞进行培养,并比较5-溴-2-脱氧尿苷、阿糖胞苷及TGF-β抑制剂的纯化效率以获取最... 详细信息

目的为了分离得到可以应用于树鼩建立人类心血管病理、毒理细胞模型的纯度较高、活力较强的心肌细胞和心肌成纤维细胞.方法使用差速贴壁1.5 h纯化心肌细胞进行培养,并比较5-溴-2-脱氧尿苷、阿糖胞苷及TGF-β抑制剂的纯化效率以获取最适纯化方案,培养过程在37℃、5％CO2条件下进行.使用MTT法测定细胞活力以确定方法可行性.利用α-横纹肌肌钙蛋白(α-SA)及心肌肌钙蛋白Ⅰ(TnⅠ)对树鼩心肌细胞进行免疫组化及免疫荧光鉴定,利用波性蛋白(Vimentin)对树鼩心肌成纤维细胞进行免疫荧光染色以达到鉴定目的.结果原代培养新生树鼩心肌细胞生长良好.在倒置显微镜下观察,培养10d左右的心肌细胞可以基本完成局部融合并有伴细胞搏动.MTT法检测结果显示心肌细胞活力可以在最少15d内保持良好水平.细胞鉴定结果显示树鼩心肌细胞α-SA免疫组化呈阳性,Tn Ⅰ免疫荧光鉴定呈阳性,心肌成纤维细胞呈阴性,符合一般心肌细胞特征;心肌成纤维Vimentin免疫荧光结果呈阳性.结论分离纯化得到的树鼩心肌细胞和心肌成纤维细胞,细胞纯度较高、结构完整并具有相对较高的细胞活力,是一种较为理想的、可以应用于树鼩建立人类心血管病理、毒理细胞模型的心肌细胞和心肌成纤维细胞.

关键词：树鼩原代培养心肌细胞心肌成纤维细胞鉴定

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BALB/c小鼠作为单纯疱疹病毒1型感染模型的免疫学分析

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微生物与感染 2017年第4期12卷 222-228页

作者：张小龙汤贝贝何玉凤段永忠王丽春张志晓周巨民李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 中国科学院/云南省动物模型与人类疾病机理重点实验室中国科学院昆明动物研究所昆明650223

在单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)小鼠感染及其相关研究中,临床病理和免疫学指标对其分析具有重要技术意义。本研究观察了HSV-1在不同条件下感染BALB/c小鼠后的多个免疫学指标,包括外周血单核细胞(peripheral bloo... 详细信息

在单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)小鼠感染及其相关研究中,临床病理和免疫学指标对其分析具有重要技术意义。本研究观察了HSV-1在不同条件下感染BALB/c小鼠后的多个免疫学指标,包括外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)群体中树突细胞比例及功能、血清中和抗体水平、PBMC中HSV-1抗原特异性T细胞水平,以及潜伏感染期小鼠神经组织中CD8^+T细胞浸润情况。结果显示,HSV-1毒株Mckrae、17^+以角膜及滴鼻途径感染3周龄及6周龄BALB/c小鼠后,小鼠PBMC中树突细胞数量增加,并显示出刺激病毒抗原特异性T细胞增殖的能力。病毒感染后35d,小鼠PBMC中未检测到白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)^+抗原特异性T细胞,但能检测到低水平的γ干扰素(interferonγ,IFN-γ)^+抗原特异性T细胞;小鼠血清中未检测到或仅能检测到低水平的中和抗体。HSV-1以皮下及足垫注射途径感染BALB/c小鼠90d后,足垫感染途径较皮下感染诱导出更高水平的血清中和抗体,PBMC中可检测到IL-4^+及IFN-γ^+抗原特异性T细胞,但不同毒株及小鼠周龄之间出现T细胞反应程度差异。组织病理学结果表明,各组小鼠三叉神经组织中均有CD8^+T细胞浸润。这些结果提示,不同HSV-1毒株以不同途径感染不同周龄BALB/c小鼠后,均可刺激树突细胞成熟及呈递病毒抗原,但血清中和抗体及PBMC中病毒抗原特异性T细胞水平在不同毒株、感染途径及小鼠周龄之间有差异。

关键词： BALB/c小鼠单纯疱疹病毒1型免疫学分析

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登革病毒四型联合重组包膜蛋白Ⅲ区的表达和免疫原性鉴定

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中国生物工程杂志 2016年第1期36卷 1-6页

作者：邱丽娟赵玉娇李多黄新伟王晓丹席珏敏潘玥陈俊英孙强明北京协和医学院/中国医学科学院医学生物学研究所昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

登革热在全球范围内广泛流行,但是目前为止却仍然没有疫苗上市,疫苗的开发迫在眉睫。抗体依赖增强感染效应是登革病毒疫苗开发中遇到的一个瓶颈问题。研究表明登革病毒的包膜蛋白Ⅲ区能够介导中和抗体产生,且诱导产生较少的交叉抗体或... 详细信息

登革热在全球范围内广泛流行,但是目前为止却仍然没有疫苗上市,疫苗的开发迫在眉睫。抗体依赖增强感染效应是登革病毒疫苗开发中遇到的一个瓶颈问题。研究表明登革病毒的包膜蛋白Ⅲ区能够介导中和抗体产生,且诱导产生较少的交叉抗体或无交叉抗体,能够大大减弱抗体依赖增强感染效应,因而是登革热重组蛋白疫苗的首选靶标。通过酵母密码子优化后合成同时包含4种血清型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区的四价联合DV EDⅢ蛋白序列,随后构建酵母表达质粒,并获得酵母表达菌株,经诱导后四联DV EDⅢ蛋白获得高效表达。通过Western blot、ELISA检测及蛋白质免疫原性鉴定,结果表明登革病毒四联DV EDⅢ蛋白表达质粒构建成功,重组蛋白在毕赤酵母获得高效表达,免疫小鼠后能够介导产生较高水平的血清效价。这表明已获得了能引起有效免疫反应的四型登革病毒EDⅢ蛋白,为登革病毒疫苗的研究提供了良好的基础。

关键词：登革病毒包膜EDⅢ蛋白疫苗重组蛋白

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树鼩脂肪转录组SNP位点发掘及其功能注释

树鼩脂肪转录组SNP位点发掘及其功能注释

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2017年第十五届中国北方实验动物科技年会

作者：罕园园孙晓梅匡德宣陆彩霞仝品芬王文广李娜余波代解杰中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南省科学技术院

从正常笼养树鼩腹部的脂肪转录组数据开发SNP分子标记。检测了6只动物共计274278568条unigene(总长度43138417bp)序列信息后,在262980条unigene(5.75%)中发现SNP位点263071个,SNP发生频率为1/164bp,其中转换(transition)177562个,颠换(transversion)85509个。在所有变异类型中,A/G和C/T发生频率最高,分别达33.85%和33.66%。将包含SNP位点的262980条unigene通过参比序列进行注释,并对其进行GO分类、COG分类注释和代谢通路注释(KEGGpathway),结合已有研究,分别筛选到1187个有GO注释、77个有COG注释和1080条个有KEGO通路注释的脂肪转录组中的可能与脂肪形成和代谢有关的SNP标记。

关键词：树鼩转录组单核苷酸多态性功能注释

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circRNA研究进展

circRNA研究进展

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第十六届中国西部实验动物管理与学术研讨会

作者：陆彩霞代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室实验树鼩标准化与应用研究省创新团队云南昆明650118

环形RNA(circular RNAs,circRNAs)是一类通过反向剪接所形成的闭合环状RNA分子,广泛存在于各种生物细胞中,并且具有结构稳定、表达量丰富以及在不同组织及其不同发育阶段具有表达特异性等特征.circRNAs可以作为miRNA海绵调控miRNA的表达... 详细信息

环形RNA(circular RNAs,circRNAs)是一类通过反向剪接所形成的闭合环状RNA分子,广泛存在于各种生物细胞中,并且具有结构稳定、表达量丰富以及在不同组织及其不同发育阶段具有表达特异性等特征.circRNAs可以作为miRNA海绵调控miRNA的表达,通过cis或trans调控其母基因的表达,并参与蛋白的翻译.此外,circRNA在神经发育及相关疾病的发生和发展过程中起着重要的调控作用,有望成为疾病诊断的分子标志物.本文就circRNA的分子特征、形成机制、功能、常用的数据库及其与神经系统疾病的关系做一综述.

关键词：环状RNA microRNA海绵 circRNA数据库神经系统

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不同诱导条件对树鼩骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

不同诱导条件对树鼩骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

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第十六届中国西部实验动物管理与学术研讨会

作者：苗雨润李娜匡德宣宋庆凯袁圆王璇张志成陆彩霞中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室实验树鼩标准化与应用研究省创新团队昆明650118

目的探讨不同诱导条件对树鼩骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)体外向成骨细胞分化的影响.方法取P3代树鼩骨髓间充质干细胞分成7组进行诱导.A组：高糖DMEM+1μM地塞米松+100μM维生素C+10mM β-磷酸甘油钠;B组：高糖DMEM+50ng/mLBMP-2;C组：... 详细信息

目的探讨不同诱导条件对树鼩骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)体外向成骨细胞分化的影响.方法取P3代树鼩骨髓间充质干细胞分成7组进行诱导.A组：高糖DMEM+1μM地塞米松+100μM维生素C+10mM β-磷酸甘油钠;B组：高糖DMEM+50ng/mLBMP-2;C组：高糖DMEM+80ng/mLBMP-2;D 组：高糖 DMEM+50μM 维生素 C+10Mmβ-磷酸甘油钠+20ng/mLBMP-2;E组：高糖DMEM+1μM地塞米松+100μM维生素C+20mMβ-磷酸甘油钠;F组：高糖DMEM+100μM地塞米松+100μM 维生素C+10mMβ-磷酸甘油钠;G组：DMEM/F12+0.1μM地塞米松+50μM维生素C+10mMβ-磷酸甘油钠.诱导18天后进行碱性磷酸酶和茜素红染色鉴定其诱导分化情况.结果每一组碱性磷酸酶染色呈不同程度的阳性，茜素红染色可在A、B、C、D和E组观察到明显矿化结节.结论 A组、B组、C组、D组和E组可以诱导树鼩BM-MSCs向成骨细胞分化，其中以A组和B组效果最为突出.

关键词：树鼩骨髓间充质干细胞成骨细胞诱导

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新型抗原递送载体:细胞溶素A融合目的蛋白整合的重组外膜囊泡的构建与鉴定

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中国生物化学与分子生物学报 2016年第11期32卷 1272-1278页

作者：王世杰黄惟巍舒聪妍黎奎夏烨李扬李慧孙鹏艳杨旭白红妹孙文佳刘存宝褚晓杰冯雪军马雁冰中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心昆明650118

细菌外膜囊泡(OMVs)是革兰氏阴性菌以出芽方式分泌的一种蛋白脂质体,可通过基因工程改造成为外源大分子抗原蛋白的载体。成孔蛋白细胞溶素A(Cly A)可作为引导序列将C-端融合的外源蛋白质定位在菌体及其所分泌的OMVs外膜上。利用Cly A融... 详细信息

细菌外膜囊泡(OMVs)是革兰氏阴性菌以出芽方式分泌的一种蛋白脂质体,可通过基因工程改造成为外源大分子抗原蛋白的载体。成孔蛋白细胞溶素A(Cly A)可作为引导序列将C-端融合的外源蛋白质定位在菌体及其所分泌的OMVs外膜上。利用Cly A融合蛋白重组的OMVs可介导抗原呈递,制备疫苗。为验证这一假说,本研究拟以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为目的蛋白,采用重组技术,构建Cly A-EGFP融合蛋白表达载体,转化*** DH5α,获得Cly A-EGFP融合蛋白整合的重组细菌OMVs,探索Cly A/EGFP融合蛋白整合的OMVs作为一种制备新型疫苗载体的可行性。重组OMVs分别经蛋白酶K和/或EDTA处理后,蛋白质印迹分析显示,Cly A-EGFP融合蛋白有效地整合在重组的OMVs中,且EGFP呈现于表面。重组OMVs与小鼠巨噬细胞Raw264.7共同孵育后,以EGFP作为标记,荧光显微镜观察显示,OMVs可被巨噬细胞吞噬、摄取。进而,荧光显微镜及流式细胞术分析证明,重组的OMVs可被骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)有效摄取,并促进BMDCs表达CD86和CD80,说明重组的OMVs可激活树突状细胞,促进其成熟。本研究结果提示,利用Cly A融合特异目的蛋白整合的重组OMVs,可作为外源蛋白质的载体,介导抗原呈递作用,在设计与制备疫苗中具有潜在的应用价值。

关键词：外膜囊泡疫苗增强绿色荧光蛋白抗原递呈细胞

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Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗毒种的遗传稳定性

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中国生物制品学杂志 2016年第4期29卷 342-347,353页

作者：邓燕朱云梁海孝杨璐洁罗娜王虓宇王海杨卉娟徐明珏杨净思孙明波中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的分析Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliomyelitis vaccine,sabin strain,s IPV）毒种（亚主种子、工作种子）及疫苗代次病毒（SO＋4）的遗传稳定性。方法比较疫苗株SabinⅠ、Ⅱ型及PfizerⅢ型亚主种子、工作种子及疫苗... 详细信息

目的分析Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（inactivated poliomyelitis vaccine,sabin strain,s IPV）毒种（亚主种子、工作种子）及疫苗代次病毒（SO＋4）的遗传稳定性。方法比较疫苗株SabinⅠ、Ⅱ型及PfizerⅢ型亚主种子、工作种子及疫苗代次病毒的感染性滴度及D抗原含量的变化情况,并对上述病毒进行全基因组测序。结果各代次Sabin株病毒滴度均维持在7.62-8.62 lg CCID50/ml,D抗原含量均维持在30-128 DU/ml。与Gen Bank上登录的SabinⅠ（AY184219.1）、Ⅱ（AY184220.1）、Ⅲ型（AY184221.1）减毒株原始种子（SO）基因序列相比,Sabin株亚主种子（SO＋2）、工作种子（SO＋3）及疫苗代次病毒（SO＋4）均未出现碱基突变。结论 s IPV毒种及疫苗代次病毒的全基因序列与原始种子相比,均未发生变化,毒力均一,遗传性状方面保持了较好的稳定性。

关键词： Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗全基因组测序遗传稳定性

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人二倍体细胞对不同病毒感染过程的生物学效应比较分析

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中国生物制品学杂志 2016年第9期29卷 907-912页

作者：王辉张莹刘龙丁廖芸王建斌胡雅洁王丽春赵婷王艳翠李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的分析人二倍体细胞对不同病毒感染的生物学反应差异性及相关分子生物学机制。方法用人类肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和人单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)感染人二倍体细胞,光镜和电镜下观察感染细胞形态... 详细信息

目的分析人二倍体细胞对不同病毒感染的生物学反应差异性及相关分子生物学机制。方法用人类肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和人单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)感染人二倍体细胞,光镜和电镜下观察感染细胞形态学特征;比较两种病毒在人二倍体细胞上的增殖动力学及两种病毒感染后细胞酶谱的变化;采用基因芯片检测两种病毒感染后人二倍体细胞基因反应的差异。结果感染细胞的光镜或电镜的超微结构观察均表现出许多相同的特点,包括细胞变圆、肿胀、折光性增强,以及细胞细微结构的受损,大多数细胞器的破坏等。两种病毒在人二倍体细胞上具有不同滴度峰值的增殖动力学过程;对细胞超氧化物歧化酶的动力学改变趋势有不同影响,但对乳酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶动力学变化趋势无明显影响;两种病毒感染引起人二倍体细胞出现不同的基因反应,其中与信号转导及与天然免疫反应有关的mRNA转录效率具有一定的差异。结论人二倍体细胞对EV71、HSV-1感染过程表现不同的生物学效应。

关键词：二倍体细胞肠道病毒71型单纯疱疹病毒1型酶谱基因表达谱

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靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白shRNA慢病毒干扰质粒的构建及鉴定

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中国生物制品学杂志 2016年第1期29卷 7-12页

作者：周艳解裕萍吴晋元闫姗姗张磊李鸿钧中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的构建靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract-binding protein,PTB)的shRNA慢病毒干扰质粒,并对其进行鉴定。方法根据Gen Bank中登录的PTB的基因序列设计并合成2条靶向MA104细胞PTB基因的shRNA干扰序列(shPTB1、sh... 详细信息

目的构建靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract-binding protein,PTB)的shRNA慢病毒干扰质粒,并对其进行鉴定。方法根据Gen Bank中登录的PTB的基因序列设计并合成2条靶向MA104细胞PTB基因的shRNA干扰序列(shPTB1、shPTB2)和1条阴性对照序列(shControl),分别插入载体p LVshRNA-EGFP(2A)Puro后,构建慢病毒重组质粒;利用HEK293Ta细胞包装针对PTB基因的shRNA的重组慢病毒颗粒;感染MA104细胞后,经Resl-time PCR、免疫荧光和Western blot法分别检测MA104细胞中PTB基因的转录和蛋白表达水平。结果 PCR及测序鉴定证明3种重组慢病毒质粒构建正确。3种重组慢病毒质粒转染HEK293Ta细胞48 h后,均可见绿色荧光表达,3组细胞的病毒滴度均为2×106 TU/ml。3种重组慢病毒感染MA104细胞48 h后均可见绿色荧光表达。经嘌呤霉素加压筛选后,p LVshPTB1-EGFP-2A和p LVshPTB2-EGFP-2A组MA104细胞仅有少量细胞于细胞核中表达,p LVshPTB1-EGFP-2A组MA104细胞中PTB基因转录及蛋白表达的水平均低于p LVshPTB2-EGFP-2A组。结论成功构建了靶向MA104细胞PTB蛋白的shRNA重组慢病毒,shRNA序列可成功下调PTB在MA104细胞中的表达,为PTB在RV增殖过程中调控作用的研究奠定了基础。

关键词： MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白慢病毒质粒 RNA干扰

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