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云南地区汉族人群PSMB8、PSMB9及TAP2基因多态性与类风湿关节炎的关联研究

中华医学遗传学杂志 2013年第2期30卷 222-226页

作者：于亮李芹林俊俞娟李倩易薇孙浩褚嘉祐杨昭庆中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所遗传室昆明650118 云南省第一人民医院风湿免疫科

目的研究云南汉族人群中PSMB8、PSMB9及TAP2基因多态性与类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的相关性。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法对177例RA患者及288名健康对照PSMB8基因的rs2071543、rs55745125、rs13863540... 详细信息

目的研究云南汉族人群中PSMB8、PSMB9及TAP2基因多态性与类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的相关性。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法对177例RA患者及288名健康对照PSMB8基因的rs2071543、rs55745125、rs138635403位点和PSMB9基因的rs17587多态性位点进行基因分型，应用多聚酶链反应扩增阻碍系统法对TAP2基因的rs2228396多态性位点进行基因分型。计算基因型及等位基因频率。采用EpiInfo7软件计算上述多态位点在RA组及正常对照组之间的比值比（OR值）。结果rs138635403及rs17587位点的等位基因及基因型频率在RA组和对照组间差异有统计学意义（P〈0．05），其中RA组rs17587的GG基因型频率（0．672）高于对照组（0．524）（OR=1．862，95％CI：1．261～2．749）。结论云南汉族人群PSMB9基因的rs17587位点多态性与RA存在关联。

关键词：类风湿关节炎遗传多态性 PSMB基因 TAP基因

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树突状细胞、CD8^+ T细胞与单纯疱疹病毒1型的潜伏感染

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中国科学：生命科学 2017年第6期47卷 606-615页

作者：张小龙李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

单纯疱疹病毒1型(HSV-1)属于疱疹病毒α亚科,是一种在人群中广泛传播的病原体.HSV-1病毒感染机体后可在宿主神经系统中建立起长期的潜伏感染,并不时地从潜伏状态"重激活"导致临床症状及体液排毒.病毒抗原特异性CD8+T细胞具有... 详细信息

单纯疱疹病毒1型(HSV-1)属于疱疹病毒α亚科,是一种在人群中广泛传播的病原体.HSV-1病毒感染机体后可在宿主神经系统中建立起长期的潜伏感染,并不时地从潜伏状态"重激活"导致临床症状及体液排毒.病毒抗原特异性CD8+T细胞具有抑制神经细胞中HSV-1"重激活",维持病毒潜伏感染状态的能力.本文从树突状细胞对病毒抗原的递呈,病毒抗原特异性CD8+T细胞的来源、种类、抗原特异性及功能等方面对近年来的研究进展做一综述.

关键词：单纯疱疹病毒1型树突状细胞 CD8+T细胞,潜伏感染

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A组人轮状病毒VP3基因的原核表达及鉴定

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中国生物制品学杂志 2012年第2期25卷 152-156页

作者：张顺潘小霞袁静文喻玲陈元鼎中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的克隆并原核表达A组人轮状病毒(Rotavirus,RV)TB-Chen株结构蛋白VP3基因,并进行分子系统进化和基因分型。方法采用PCR法扩增A组人轮状病毒TB-Chen株VP3编码基因,克隆至pETL载体上,构建重组原核表达质粒pET-VP3,转化大肠杆菌BL21(DE3)... 详细信息

目的克隆并原核表达A组人轮状病毒(Rotavirus,RV)TB-Chen株结构蛋白VP3基因,并进行分子系统进化和基因分型。方法采用PCR法扩增A组人轮状病毒TB-Chen株VP3编码基因,克隆至pETL载体上,构建重组原核表达质粒pET-VP3,转化大肠杆菌BL21(DE3),并进行表达。表达的重组蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,对VP3基因进行分子系统进化及基因型分析。结果重组表达质粒pET-VP3经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为98 000,以包涵体形式存在;重组VP3蛋白可被抗SA11株全病毒豚鼠免疫血清识别;迄今发现的A组RV VP3可分为7个基因型,TB-Chen株和SA11株VP3基因分别属于M2型和M5型。结论成功原核表达了A组人RV TB-Chen株VP3蛋白,为进一步研究VP3的结构功能及开发新型RV疫苗、诊断试剂和治疗药物奠定了基础。

关键词：轮状病毒属 VP3基因原核细胞基因表达基因分型

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2009年中国云南昆明地区柯萨奇病毒A组16型遗传特性分析

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中国生物制品学杂志 2012年第1期25卷 9-12页

作者：马绍辉陈俊英李华杨卉娟施海晶潘玥孙强明李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的对2009年中国云南昆明地区柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CoxA16)毒株的部分VP1区进行分析,了解CoxA16的遗传特性。方法设计针对肠道病毒A群的通用引物,采用半巢式RT-PCR扩增目的片段,对PCR产物测序;使用Omiga和Mega4.1等... 详细信息

目的对2009年中国云南昆明地区柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CoxA16)毒株的部分VP1区进行分析,了解CoxA16的遗传特性。方法设计针对肠道病毒A群的通用引物,采用半巢式RT-PCR扩增目的片段,对PCR产物测序;使用Omiga和Mega4.1等生物学软件进行核苷酸、氨基酸序列比对及病毒的系统进化分析。结果200份2009年昆明市儿童医院临床诊断为手足口病或并发脑炎疑似肠道病毒感染的患者粪便标本中有52份为CoxA16感染,其中15份来自脑炎患者。52株CoxA16病毒部分VP1区核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,核苷酸序列同源性为98.5%～100%,氨基酸序列同源性为98.8%～100%;与shzh00-2、shzh99-48和107/Toyama/1990相比较,核苷酸序列同源性为92.3%～93.8%,氨基酸序列同源性为95.3%～96.8%;与国际标准株G10相比较,核苷酸序列同源性为78.5%～80.3%,氨基酸序列同源性为93.2%～94.5%;与其他13个参考株的核苷酸序列同源性为96.6%～99.5%,氨基酸序列同源性为98.3%～100%。基因系统进化分析显示,52株CoxA16均属于B基因型的一个分支。结论 2009年中国云南昆明地区CoxA16株属于B2亚型。

关键词：柯萨奇病毒A组16型 VP1 序列分析

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人诺如病毒最新研究进展

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病毒学报 2017年第5期33卷 785-790页

作者：宋杰董少忠中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

人诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是杯状病毒科(Caliciviridae)的一种单股正链RNA病毒,它是导致全球急性非细菌性肠胃炎暴发的主要病原体之一。自1972年美国学者Kapikian利用透射电镜首次观察到首株诺瓦克病毒(Norwalk virus,NV)以... 详细信息

人诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是杯状病毒科(Caliciviridae)的一种单股正链RNA病毒,它是导致全球急性非细菌性肠胃炎暴发的主要病原体之一。自1972年美国学者Kapikian利用透射电镜首次观察到首株诺瓦克病毒(Norwalk virus,NV)以来,该病毒在全球范围内多次广泛流行。据报道,全球每年有超过1亿人因感染HuNoVs而发病,其临床症状主要为恶心、呕吐、腹痛和腹泻,多数患者表现为自限性,但也会导致少数婴幼儿、老人和免疫缺陷患者发展成重症,甚至死亡。HuNoVs引起的疫情暴发给全球的公共卫生安全带来了较大的威胁。本文将对HuNoVs的病原学及流行病学、体外培养体系、动物模型、免疫反应和疫苗研发的最新研究进展进行概述。

关键词：诺如病毒(NoVs) 体外培养系统动物模型免疫反应疫苗研发

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人Semaphorin 4D慢病毒载体的构建及鉴定

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中国生物工程杂志 2011年第7期31卷 1-7页

作者：孙强明潘玥赵玉娇陈俊英施海晶马绍辉北京协和医学院/中国医学科学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的:构建并制备能够有效表达Semaphorin 4D的重组慢病毒。方法:从人急性T细胞白血病Jurkat细胞DNA扩增人Semaphorin 4D基因,克隆至pWPI GW慢病毒载体上,与pVSVG及pSPAX质粒共转染人胚肾293T细胞,包装出重组慢病毒,将纯化后的重组病毒... 详细信息

目的:构建并制备能够有效表达Semaphorin 4D的重组慢病毒。方法:从人急性T细胞白血病Jurkat细胞DNA扩增人Semaphorin 4D基因,克隆至pWPI GW慢病毒载体上,与pVSVG及pSPAX质粒共转染人胚肾293T细胞,包装出重组慢病毒,将纯化后的重组病毒直接感染293T和HUVEC细胞,通过免疫印迹、免疫荧光染色和血管内皮细胞迁移分析等方法检测Semaphorin 4D的表达和诱导血管内皮细胞迁移的作用。结果:重组慢病毒介导Semaphorin 4D在293T和HUVEC内获得表达,能介导血管内皮细胞迁移。结论:成功构建了表达Semaphorin 4D的重组慢病毒载体。

关键词： Semaphorin 4D 慢病毒血管新生基因治疗

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体外研究脊髓灰质炎病毒Ⅰ型疫苗株结构蛋白对人呼吸道上皮细胞内天然免疫反应系统的作用及其免疫学意义

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病毒学报 2019年第2期35卷 225-232页

作者：吴化叶牟唐维王建斌柳蕾程继帅冯敏王丽春张莹李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

尽管针对脊髓灰质炎病毒已经有长达数百年的研究并成功研制出了预防性疫苗,但是对于该病毒如何启动机体天然免疫反应,进而激活获得性免疫反应这一过程的具体分子机理仍有诸多空白。本研究通过体外分析脊髓灰质炎病毒Sabin减毒株Ⅰ型的... 详细信息

尽管针对脊髓灰质炎病毒已经有长达数百年的研究并成功研制出了预防性疫苗,但是对于该病毒如何启动机体天然免疫反应,进而激活获得性免疫反应这一过程的具体分子机理仍有诸多空白。本研究通过体外分析脊髓灰质炎病毒Sabin减毒株Ⅰ型的结构蛋白对人呼吸道上皮细胞内天然免疫反应信号分子的影响,了解脊髓灰质炎病毒在上皮细胞中启动免疫信号的具体分子机制。采用PCR方法扩增脊髓灰质炎病毒四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4,经酶切纯化后与pcDNA3.1+真核表达载体连接,分别构建含目的基因的四种重组质粒。将重组质粒分别转染至人呼吸道上皮细胞16HBE中,48h后收集培养上清、细胞。提取细胞的总RNA,利用Q-PCR法分别检测四种结构蛋白表达所诱导的天然免疫信号分子的mRNA表达量。同时,上清、细胞裂解物分别与人T细胞共培养,检测其对T细胞增殖的影响。体外在16HBE细胞中分别表达SabinⅠ病毒VP1～VP4四种结构蛋白均可刺激如LTα3、NIK等NF-κB天然免疫信号通路相关分子的表达,并且表达这四种蛋白的细胞裂解物与T细胞共培养后均表现出刺激T细胞非特异性增殖的效应。但是,仅有VP1、VP2表达所诱导分泌相关因子的培养上清才表现出间接刺激T细胞增殖的能力。SabinⅠ毒株的四种结构蛋白可激活NF-κB信号通路,促进T细胞的非特异性增殖,从而激活适应性免疫应答。

关键词：脊髓灰质炎脊髓灰质炎病毒(PV) 结构蛋白信号通路 NF-κB

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单纯疱疹病毒Ⅱ型经不同途径感染BALB/c小鼠的病理学研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2019年第7期39卷 485-491页

作者：曾洁媛李琦涵范胜涛廖芸冯敏徐兴丽沈冬王建斌程继帅张莹昆明医科大学基础医学院 650500 中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的观察并比较分析单纯疱疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virus type 2,HSV-2)经不同途径感染小鼠后的致病情况。方法将6周龄雌性BALB/c小鼠分为实验组和对照组。实验组小鼠分别经滴鼻、生殖道途径感染HSV-2(每只104CCID50/20 μl),对照组... 详细信息

目的观察并比较分析单纯疱疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virus type 2,HSV-2)经不同途径感染小鼠后的致病情况。方法将6周龄雌性BALB/c小鼠分为实验组和对照组。实验组小鼠分别经滴鼻、生殖道途径感染HSV-2(每只104CCID50/20 μl),对照组小鼠经上述两种途径注射PBS。感染后不同时间点,分别取肺、神经系统、生殖系统组织进行病理学观察及病毒载量检测。通过原位杂交对小鼠三叉和骶神经节中lat基因的表达进行定位,同时对组织中病毒进行重激活检测。结果两种途径感染HSV-2的小鼠体重在6 d后均呈下降趋势,且均能观察到组织病理损伤。鼻腔感染以肺泡壁充血、脑血管袖套、淋巴细胞浸润等肺部、中枢神经系统病理损伤为主;而生殖道感染组主要出现是骶神经节坏死、阴道和子宫嗜酸性粒细胞增多、卵巢充血等生殖道病理现象。经两种途径感染的小鼠组织器官中病毒载量的情况也印证了上述病理结果,即鼻腔感染组小鼠的神经、肺组织中病毒载量明显高于生殖道组,而生殖道感染组小鼠的生殖道和骶神经节中病毒增殖则明显高于鼻腔感染组。感染后28 d,在处于潜伏感染小鼠的三叉和骶神经节中均能检测到HSV-2 lat基因mRNA的阳性信号,并且采集的组织碎块均能在与Vero细胞共培养时使细胞病变,且生殖道感染组的lat基因阳性信号及重激活后病毒增殖趋势相对高于鼻腔感染组。结论HSV-2通过鼻腔和生殖道两种途径感染BALB/c小鼠均能引起组织病理损伤,且病理损伤空间特异性与感染途径密切相关。

关键词：单纯疱疹病毒Ⅱ型生殖道感染鼻腔感染病理学分析

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Ⅰ型登革病毒D06063株人二倍体细胞适应株的筛选及纯化

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中国生物制品学杂志 2012年第12期25卷 1611-1614页

作者：赵玉娇潘玥陈俊英杨丽娟岳耀斐施海晶马绍辉孙强明中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的筛选Ⅰ型登革病毒(Dengue virus,DV)中国株D06063人胚肺二倍体细胞KMB17的适应株,经噬斑纯化后,分析其生物学特性。方法将Ⅰ型DV中国株D06063在C6/36细胞上进行扩增,采用微量滴定法测定病毒的感染性滴度;RT-PCR法鉴定DV型别;病毒连... 详细信息

目的筛选Ⅰ型登革病毒(Dengue virus,DV)中国株D06063人胚肺二倍体细胞KMB17的适应株,经噬斑纯化后,分析其生物学特性。方法将Ⅰ型DV中国株D06063在C6/36细胞上进行扩增,采用微量滴定法测定病毒的感染性滴度;RT-PCR法鉴定DV型别;病毒连续以4.0 MOI的量感染KMB17细胞,传代至病毒完全适应在细胞内扩增,再连续传10代,筛选出KMB17细胞适应株,并进行3轮噬斑纯化;免疫荧光法检测纯化病毒,电镜观察病毒颗粒的形态。结果在C6/36细胞上扩增的Ⅰ型DV D06063株的滴度为6.0 lg CCID50/ml,经RT-PCR可扩增出511 bp的DV特异基因和482 bp的Ⅰ型DV型特异性基因;病毒感染KMB17细胞后,可产生明显的细胞病变,至第10代,病毒的感染性滴度达峰值,为6.75 lg CCID50/ml;纯化的病毒经免疫荧光检测呈阳性,电镜观察显示病毒形态正常。结论成功筛选出传代稳定性好、病毒扩增量高的Ⅰ型DVKMB17细胞适应株,纯化的病毒株保持了原始毒株的基本生物学特性。

关键词：登革病毒人胚肺二倍体细胞噬斑纯化生物学特性

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Ⅲ型登革病毒D9964株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应株选育纯化及其增殖动力学研究

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病毒学报 2013年第3期29卷 287-292页

作者：赵玉娇潘玥阎玲梅岳耀斐杨丽娟陈俊英马绍辉施海晶孙强明中国医学科学院、北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

选育出Ⅲ型登革病毒中国株在人胚肺二倍体细胞KMB17上的适应株并对其生物学特性和增殖动力学进行研究,为研究登革病毒减毒活疫苗奠定基础。Ⅲ型登革病毒中国株D9964经RT-PCR鉴定型别正确后,进行毒种扩增和滴度测定;以4.0MOI接种KMB17细... 详细信息

选育出Ⅲ型登革病毒中国株在人胚肺二倍体细胞KMB17上的适应株并对其生物学特性和增殖动力学进行研究,为研究登革病毒减毒活疫苗奠定基础。Ⅲ型登革病毒中国株D9964经RT-PCR鉴定型别正确后,进行毒种扩增和滴度测定;以4.0MOI接种KMB17细胞,反复传代直至病毒能在细胞中适应和增殖;连续传10代,选育出KMB17细胞适应株,经三轮噬斑纯化筛选适应株,微量滴定法检测10代病毒培养液的感染性滴度;免疫荧光法检测纯化病毒株的抗原性;将病毒纯化株接种KMB17细胞,取第3～7d细胞提取RNA,以Real-time PCR检测病毒适应株在细胞中的增殖动态。结果显示,经适应性培养后Ⅲ型登革病毒中国株D9964能在KMB17细胞中稳定增殖,经噬斑纯化获得了高纯度的细胞适应株,病毒保持了原始毒株良好的抗原性;增殖动力学研究显示第5～6d为病毒在细胞内的增殖高峰期。

关键词：登革病毒人胚肺二倍体细胞适应性增殖动力学

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